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Da Inglese a Italiano: MyoD88-knockout mouse as a model animal unresponsive to bacterial cell wall components (by Japan Science and Technology Agency JP) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese MyoD88-knockout mouse as a model animal unresponsive to bacterial cell wall components
Description
Technical Field
The present invention relates to uses of model non-human animals which are unresponsive to bacterial cell wall components. The bacteria cell wall component may be a lipoprotein/lipopeptide, which is a cell component of bacteria that belong to Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia or the like. The bacterial cell wall component may be a peptidoglycan, which is a cell wall fraction of Gram-positive bacteria. Alternatively the bacterial cell wall component may be endotoxin, which is a cell wall fraction of Gram-negative bacteria.
Background Art
Cytokines are intracellular signal transmitters which play an important role in an immune response, a response upon infection, hematopoiesis, inhibition of virus infection and tumor cells. Among them, a cytokine which transmits signals between lymphocytes is called interleikin (hereinafter, "IL"). Among ILs, IL-1 is a cytokine which mediates various immune responses and inflammatory responses, and is involved in maintenance of homeostasis of living organisms and produced from various cells such as monocytes, macrophages, keratinocytes, vascular endothelial cells and the like when the living organisms get infected or hurt. It has been known that there are two kinds of IL-1, IL-1α and IL-1β, both of which combine to the same receptor. It has been also known that IL-1 exerts its function simultaneously with the activation by an antigen to T cell and by mitogens, makes T cells release IL-2, and enhances the expression of IL-2 receptors to induce T cell proliferation, and that it acts on monocytes and macrophages in order to induce the production of TNF-α, IL-1, IL-6.
IL-1 has two kinds of IL-1 receptors (hereinafter "IL-1R"), and both of the IL-1Rs, type I and type II, have three immunogloblin-like domains in their extracellular domains. Type I receptors express in T cells and connective tissue, and type II receptors express in splenic B cells, myeloids and the like, and it has been known that type I receptors induce NF-κB in nuclei. It has been also known that there is an IL-1 receptor antagonist (hereinafter "IL-1ra") which shows no bioactivity in spite that it binds to IL-1R with the affinity similar to that of IL-1α and IL-1β, and that it prevents IL-1 from binding to IL-1R competitively.
IL-18 is known to promote the production of interferon-γ (hereinafter "IFN-γ"), to enhance the activation of natural killer cells, to induce the production of IFN-γ from T cells in cooperation of IL-12, and to act an important role in a Th1 (IL-2 producting helper T cells) response. Further, it is known that IL-18 has no structural similarity to IL-12 in spite that it has a functional similarity, and has a structural similarity to IL-1. Moreover, it has been also known that IL-18 is produced as an inactive precursor that requires cleavage by IL-1β-converting enzyme (ICE)/caspasel for its maturation, as in the case of IL-1β, and that IL-18 activates IL-1R-associated kinase (IRAK) and NF-κB.
A plurality of molecules showing homology to IL-1R have been identified so far, and signal pathways mediated by IL-1R family is being studied intensively now. It has been known that MyD88 is a cytoplasmic protein comprised of an IL-1R homologous domain and a Death domain, and functions as an adaptor molecule which activates NF-κB by recruiting IRAK to IL-1R complex after IL-1 stimulation, and that MyD88 gene was originally separated as a myeloid differentiation primary response gene, which rapidly induces M1 myeloleukemic cells to macrophages by IL-6-stimulated differentiation.
Toxins in bacterial cells being comprised of lipopolysaccharide, which is a major structural component of the outer membrane encompassing peptidoglycan on the surface of Gram-negative bacteria, are called endotoxin, and it has been known that lipopolysaccharide is comprised of lipid called lipid A and various kinds of saccharide which covalently bind to the lipid A. It has been also known that this endotoxin has a bioactivity mainly involved in fever, decrease of leukocytes and platelet, hemorrhagic necrosis of bone marrow cells, hypoglycemia, induction of IFN, activation of B limphocyte (immune response cell derived from marrow), and the like.
It has been known that a Toll gene is required to control dorsoventral patterning during the embryonic development of Drosophila (Cell 52, 269-279,1988, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996), and for antifungal immune responses in adult fly (Cell 86, 973-983, 1996). It has been clarified that the Toll is a type I transmembrane receptor with an extracellular domain containing leucine-rich repeat (LRR) and that its cytoplasmic domain shows high homology to that of mammalian interleukin-1 recepter (IL-1R)(Nature 351, 355-356, 1991, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996, J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998). It has been also clarified that another Toll family member, 18-wheeler, participates in the antibacterial host defense but not in the antifungal immune response, and that particular pathogens induce specific antimicrobial immune responses in Drosophila through the selective activation of the Toll pathways (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14614-14619, 1997, EMBO J. 16, 6120-6130, 1997, Curr. Opin. Immunol. 11, 13-18, 1999).
Recently, mammalian homologs of Toll, designated as Toll-like receptors (TLRs), have been identified, and so far, six families including TLR2 and TLR4 have been reported (Nature 388, 394-397, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998, Blood 91, 4020-4027, 1998, Gene 231, 59-65, 1999). It has been known that the TLR families, as in the case of the IL-1R, recruit IL-1R-associated kinase (IRAK) through the adaptor protein MyD88 as a signal transmitter and activate TRAF 6, and then activate NF-κB in the downstream (J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998, Mol. Cell 2, 253-258, 1998, Immunity 11, 115-122, 1999). Further, the role of the TLR families in mammals is also believed to participate in innate immune recognition as pattern recognition receptors (PRRs), which recognize bacterial cell common structures (Cell 91, 295-298, 1997).
It has been reported that one of such pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) to be recognized by the PRRs is lipopolysaccharide (LPS), a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria (Cell 91, 295-298, 1997), that said LPS stimulates host cells and makes them produce various proinflammatory cytokines including TNF-α, IL-1, and IL-6 (Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979, Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995), and that the LPS captured by LPS-binding protein (LBP) is delivered to CD14 on the cell surface (Science 249, 1431-1433, 1990, Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995). However, since CD14 is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein without a transmembrane domain, the existence of a bona fide signaling receptor of LPS has been believed.
TLR4, which belongs to the TLR family, is a signaling molecule of LPS, which is a bacterial cell component of Gram-negative bacteria, and transfection of the TLR4 leads to a low constitutive activation of NF-κB (J. Exp. Med. 188, 2091-2097, 1998, Nature 395, 284-288, 1998). On the other hand, as TLR2 transmits LPS signal when overexpressed in human embryonic kidney 293 cells in vitro, TLR2 has been thought to be a candidate for the LPS receptor. In addition, Godawski's group has reported that human TLR2 could interact with CD14 to form the LPS receptor complex (J. Immunol. 163; 639-643, 1999). Stimulation treatment with LPS leads to oligomerization of receptors and to subsequent recruitment of IRAK to the receptor complex. In contrast, groups of Poltorak and Qureshi have reported that TLR4 is the causative gene of the LPS hyporesponsiveness of C3H/HeJ mice, that is, the Lps gene, according to positional cloning (Science 282, 2085-2088, 1998, J. Exp. Med. 189, 615-625, 1999).
The inventors of the present invention have found by generation of TLR4-deficient mice that TLR4 is actually involved in LPS signaling (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). The findings may be attributed to species-specific differences in the primary structure of TLR, in other words, LPS signaling could be mediated by TLR4 in mice and by TLR2 in humans. However, there is a report showing that mouse TLR2 also activated NF-κB in response to LPS (J. Immunol. 162, 6971-6975, 1999). In addition, Chow et al. have reported that they obtained the result showing that human TLR4 activated NF-κB-mediated gene expression by stimulation to LPS/CD14 in a dose-dependent or a time-dependent manner, which is consistent with the observation of C3H/HeJ mice, whereas they obtained the result conflicting with that of Kirschning's group when human 293 cells were used, and they have speculated that the differences of outcome may be due to differences in the lot of 293 cells as well (J. Biol. Chem. 274, 10689-10692, 1999).
Recently, it has been reported that TLR2 may not be involved exclusively in responsiveness to LPS derived from Gram-negative bacteria (J. Immunol. 162, 6971-6975, 1999) but may also act as a signaling receptor for peptidoglycan (PGN) and lipoteichoic acid (LTA) from Gram-positive bacteria , which have another common bacterial structural pattern (J. Biol. Chem. 274, 17406-17409, 1999, J. Immunol. 163, 1-5, 1999). Further, it has been also reported that whole Gram-positive bacteria, soluble PGN, and LTA induced the activation of NF-κB in 293 cells expressing TLR2, but not induced the activation of NF-κB in the cells expressing TLR1 or TLR4 (J. Biol. Chem. 274, 17406-17409, 1999). Still further, it has been also reported that Chinese hamster ovary (CHO) fibroblast cells which express human TLR2 but not TLR4 were activated similarly by heat-killed Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae, and PGN derived from Staphylococcus aureus (J. Immunol. 163, 1-5, 1999).
Mycoplasmas, known as pathogens in animals and humans, are wall-less bacteria, yet they are capable of activating macrophages. A number of reports have identified this macrophage-activating material as lipoproteins/lipopeptides, and one of these lipopeptides, the 2kD macrophage-activating lipopeptide MALP-2 derived from Mycoplasma fermentans, was biochemically fully characterized and has become available by synthesis (J. Exp. Med. 185:1951, 1997). It is known that the lipid moiety has 2 asymmetric C atoms, and that the synthetic MALP-2 comprised of the S, R racemate had a specific activation similar to the natural compound action at picomolar concentrations in vitro. Little is known about the signal pathways or the cell-surface receptors for MALP-2, except that MALP-2 activates NF-κB.
It is reported that lipoproteins/lipopeptides from mycobacterium and Borrelia burgdorferi induced the activation of host cells through TLR2 in vitro (Science 285, 736-739, 1999, Science 285, 732-736, 1999). Nevertheless, the conclusions obtained from overexpression experiments do not necessarily reflect the function of TLR family in vivo. It is also reported that the results of analysis of the responsiveness based on NF-B activation are not related to biological responses mediated by these stimuli (Infect. Immun. 66, 1638-1647, 1998).
In addition, it is known that the function of a specific gene can be analyzed in individual level by using transgenic mice in which genes are artificially introduced and expressed, and gene-deficient mice generated by gene targeting in which specific genes on genomes are artificially transformed by homologous recombination with embryonic stem cells (hereinafter "ES cells"). In general, gene-deficient mice are called knockout mice, and TLR2 knockout mice and MyD88 knockout mice have not been known, and moreover, it has not been known that TLR2 knockout mice and MyD88 knockout mice are unresponsive to bacterial cell components, either.
Summary of the Invention
Though in vivo responses to bacterial cell components are expected to vary depending on the difference of expression levels of each TLR on the cell surface, the contribution of individual members of the TLR family and MyD88, the adaptor protein of the TLR family, to signaling by bacterial cell components' stimuli in vivo remains to be elucidated. An object of the present invention is to provide the use of a non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome as a model animal unresponsive to bacterial cell wall components. Such animals are useful for elucidating the contribution of MyD88, the adaptor protein of the TLR family; to signaling by bacterial cell components' stimuli in vivo, in particular, the role of MyD88 in vivo.
The inventors of the present invention have conducted intensive study for attaining the object. They generated MyD88 gene-deficient mice as follows: an exon region including two-exon regions encoding the C-terminal portion of MyD88 are replaced with the neomycin-resistant gene respectively by homologous recombination with plasmid vectors in ES cells and HSV-tk gene was induced into each C-terminal side respectively, and ES cell clones doubly resistant of G418 and gancyclovir were screened; the ES cell clones were microinjected into blastocysts of C57BL/6 mice; MyD88 knockout mice whose function of MyD88 gene is deficient on their chromosomes were born through the germline at the expected Mendelian ratios. Then the inventors have found that those MyD knockout mice are transgenic mice which grow healthy and show no obvious abnormalities until 20 weeks of age, and that those MyD knockout mice are unresponsive to peptidoglycan, which is a cell wall component of Gram-positive bacteria and to a lipoprotein/lipopeptide and other such bacterial cell components, and the present invention has thus completed.
The present invention relates to the use of a non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome as a model animal unresponsive to bacterial cell wall components (claim 1). The non-human animal may be a rodent (claim 2), or a mouse (claim 3).
The present invention also relates to the use of a macrophage or splenocyte cell derived from a non-human animal as defined in any of claims 1 to 3 as a model cell unresponsive to bacterial cell wall components (claim 4).
The present invention may be used to elucidate the action mechanisms of bacterial cell components (claim 5).
The present invention may be used to obtain information of signalling receptors of bacterial cell wall components (claim 6).
The present invention may be used in a method of detecting bacterial cell components, which method comprises the steps of: (i) administering the subject material to a) an animal or cell as defined in any of claims 1 to 4 and b) to a wild-type non-human animal or cell and (ii) assessing and comparing responsiveness to the subject material (claim 7).
The present invention may be used to obtain information for development of medicines for diseases caused by excessive production of bacterial cell wall components (claim 8).
In connection with the use of the present invention, the bacterial cell wall component is a lipoprotein/lipopeptide (claim 9). The lipoprotein/lipopeptide may, for example be derived from cell components of bacteria which belong to Mycoplasma, Spirochaeta or Escherichia (claim 10).
In connection with the use of the present invention the bacterial cell wall component is a peptidoglycan (claim 11), an endotoxin (claim 12), lipotechoic acid (claim 13) or Mycobacterium tuberculosis lysate (claim 14).
The present invention may be used to establish a treatment method for endotoxin shock (claim 15).
The present invention may be used to elucidate the molecular mechanism in a process of infection by bacteria to the cell wall components of which the animal is unresponsive (claim 16).
The present invention may be used to develop new remedies for infection by bacteria to the cell wall components of which the animal is unresponsive (claim 17).
Brief Explanation of Drawings
Fig. 1 is a graph showing gene maps of MyD88 knockout mice and wild-type mice.
Fig. 2 is a graph showing survival indices of MyD88 knockout mice and wild-type mice having an injection of LPS derived from Escherichia coli.
Fig. 3 is a graph showing the results of T cell proliferation mediated by IL-1 in MyD88 knockout mice and wild-type mice .
Fig. 4 is a graph showing the results of IL-1-induced TNF-α and IL-6 levels in blood in MyD88 knockout mice and wild-type mice.
Fig. 5 is a graph showing the results of NK cell activation mediated by IL-18 in MyD88 knockout mice and wild-type mice.
Fig. 6 is a graph showing the results of the production of IFN-γ stimulated by IL-12 and IL-18 in MyD88 knockout mice and wild-type mice.
Fig. 7 is a graph showing that the mutation of dominant negative MyD88 is involved in IL-18-induced NF-κB activity and AP-1 activity.
Fig. 8 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to Salmonella minnesota Re-595.
Fig. 9 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to IL-4 and interferon-γ.
Fig. 10 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to Porphyromonas gingivalis.
Fig. 11 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to Escherichia coli 055:B5.
Fig. 12 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to peptidoglycan.
Fig. 13 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to lipoteichoic acid.
Fig. 14 is a graph showing the results of responsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to whole cell lysates of Mycobacterium tuberculosis.
Fig. 15 is a graph showing gene maps of TLR2 knockout mice and wild-type mice.
Fig. 16 is a graph showing survival indices of TLR2 knockout mice and wild-type mice having an injection of LPS derived from Escherichia coli.
Fig. 17 is a graph showing lipid A- or LPS-induced production amount of IL-6, TNF-α or NO2- in TLR2 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice.
Fig. 18 is a graph showing the results of responsiveness of splenic B cells of TLR2 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to LPS derived from Salmonella minnesota Re-595.
Fig. 19 is a graph showing the results of responsiveness of peritoneal macrophages of TLR2 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice to cell wall fractions of Gram-positive bacteria.
Fig. 20 is a graph showing PGN- or LTA-induced production amount of IL-6, NO2- or TNF- in TLR2 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice.
Fig. 21 is a graph showing the results of LPS- or PGN-stimulated in vitro kinase assay, Western blot analysis and electrophoretic mobility shift assay in TLR2 knockout mice, wild-type mice and TLR4 knockout mice.
Fig. 22 is a graph showing the results of responsiveness of peritoneal macrophagesof CH3/HeJ mice to lipopeptide MALP-2.
Fig. 23 is a graph showing the results of responsiveness of human monocytes to lipopeptide MALP-2.
Fig. 24 is a graph showing the results of responsiveness of peritoneal macrophages of TLR2 knockout mice, wild-type mice, TLR4 knockout mice and MyD88 knockout mice to lipopeptide MALP-2.
Fig. 25 is a graph showing the results of lipopeptide MALP-2-stimulated in vitro kinase assay, Western blot analysis and electrophoretic mobility shift assay in TLR2 knockout mice, wild-type mice, TLR4 knockout mice and MyD88 knockout mice.
Best Mode for Carrying out the Invention
Examples of bacterial cell components include: a lipoprotein/lipopeptide, which is a cell component of bacteria which belong to Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia; peptidoglycan comprised by combining repeating polysaccharides of N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid, which is a skeletal structure of bacterial cell wall, and relatively short peptide chain; lipopolysaccharide (LPS) which exists mainly as an outer membrane component of Gram-negative bacteria and is also called endotoxin; lipoteichoic acid (LTA), which is a cell wall component of Gram-positive bacteria; Mycobacterium tuberculosis lysate; and a cell wall fraction of Gram-positive bacteria. Further, in connection with the present invention, carriers which carry the above mentioned bacterial cell components, and the bacterial cell themselves are expediently included in the examples of the bacterial cell components.
In connection with the present invention, "unresponsiveness to bacterial cell components" means that the non-human animals, or cells, tissue, or organs derived therefrom show low reactivity or almost no reactivity to the stimuli of the bacterial cell components, and "hyporesponsiveness" means low reactivity to the stimuli. Therefore, a model non-human animal being unresponsive to bacterial cell components in connection with the present invention means a non-human animal such as a mouse, a rat, a rabbit or the like, where living organisms, or cells, tissue, or organs which comprise living organisms show low reactivity or almost no reactivity to the stimuli of the bacterial cell components. Examples of the stimuli of the bacterial cell components include an in vivo stimulus where a bacterial cell component is administered to a living organism and an in vitro stimulus where a bacterial cell component is brought into contact with cells separated from a living organism. As a example of a model non-human animal being unresponsive to bacterial cell components, a non-human animal unresponsive to bacterial cell components such as a lipoprotein/lipopeptide, peptidoglycan, a cell wall fraction of Gram-positive bacteria, endotoxin, lipoteichoic acid, Mycobacterium tuberculosis lysate and the like is exemplified, and specifically, a non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome, such as a MyD88 knockout mouse and the like are exemplified.
In connection with the present invention, "deficiency of MyD88 gene function on a chromosome" means that a part of or a whole of MyD88 gene on a chromosome is deficient and the function to express MyD88, which is expressed in wild-types, is lost. Examples of a non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome include a rodent such as a rat or the like whose function of MyD88 gene is deficient other than MyD88 knockout mice.
The term "a wild-type non-human animal" in connection with the present invention means a non-human animal being the same species of the non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome. For example, in case of mice, it means MyD88-nondeficient type mice of same species among F2 mice generated at the expected Mendelian ratio. When the deficient type and the wild-type mice of these F2 mice, in particular, the wild-type littermates are used for experiments simultaneously, it becomes possible to conduct precise comparative experiments at individual level. With an example of knockout mice which have deficiency in MyD88, a generating method of the non-human animal whose function of MyD88 gene is deficient on its chromosome will now be explained.
MyD88 gene can be cloned by amplifying a mouse genomic library by PCR or other methods with a probe derived from a mouse EST clone or the like. By DNA recombination technique a part of or a whole of this cloned MyD88 gene, for example, a part or a whole of an exon region containing a cytoplasmic region of MyD88 gene is replaced with a poly A signal and a marker gene such as a neomycin resistance gene or the like, a targeting vector is constructed by inducing genes such as diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene or the like into 5'-terminal side, this constructed targeting vector is linearized, and introduced into embryonic stem cells (ES cells) by electroporation method or the like, then cultured, and subsequently Es cells achieving homologous recombination by G418, ganciclovir (GANC) or other such antibiotics are selected. It is preferable to confirm whether these selected ES cells are the object recombinants by Southern blot analysis or the like.
Chimeric mice can be obtained by microinjecting the recombined ES cells into blastocysts of mice, and put the blastocysts back into uteri of recipient mice. Under high chimeric ratio, there will be born much more male chimeric mice than female ones. In such case, heterologous recombinant mice ( /-: F1) are generated by interclossing the chimeric mice with female wild-type mice, and the homologous recombinant mice [F2; wild-type mice ( / ), MyD88 knockout mice (-/-)] can be obtained by mating the heterologous recombinant male mice and female mice. All of these mice are generated at the expected Mendelian ratio. As the method of confirming whether MyD88 knockout mice of the present invention are born, for example, the method wherein RNA is isolated from peritoneal macrophages of mice obtained by the above-stated method, and is examined by Northern blot analysis or the like, and the method wherein the expression of MyD88 in the mice is examined by Western blot analysis or the like are exemplified.
It is possible to confirm that the generated MyD88 knockout mice are unresponsive to cell wall components of bacteria, for example, by contacting a lipoprotein/lipopeptide, which is a cell component of bacteria which belong to Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia or the like with macrophages of MyD88 knockout mice or human monocytes in vitro, and then measuring the production amount of TNF-α or NO2- in the cells; by injecting LPS, which is a cell wall component of Gram-negative bacteria into MyD88 knockout mice by intravenous injection or the like, and then measuring bioactivity of endotoxin such as fever, shock, decrease of leukocytes or platelet, hemorrhagic necrosis of bone marrow cells, hypoglycemia, induction of IFN, activation of B limphocyte (immune response cell derived from marrow) or the like; by measuring the induction of IFN, proliferative response of splenic B cells, the expression of MHC class II antigen on the surface of splenic B cells, in macrophages or splenic B cells of MyD88 knockout mice, in the presence of LPS derived from bacteria, or peptidoglycan, which is a cell component of Gram-negative bacteria, lipotheichoic acid, Mycobacterium tuberculosis lysate or the like.
The MyD88 knockout mice used in the present invention are unresponsive to a lipoprotein/lipopeptide, which is a bacterial cell component, and show lower responsiveness to endotoxin than C3H/HeJ mice, which have been known as being hyporesponsive to endotoxin so far, and no shock symptom has been observed. Moreover, macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice are unresponsive not only to endotoxin but also to peptidoglycan being a cell wall component of Gram-positive bacteria, lipotheichoic acid, Mycobacterium tuberculosis lysate and the like, while they are responsive to IL-4 and IFN-. Therefore, the knockout mice being unresponsive to bacterial cell components can be used as useful model for elucidating action mechanisms of a lipoprotein/lipopeptide, endotoxin, peptidoglycan, lipotheichoic acid or the like, and for establishing a treatment method for endotoxin shock.
The present invention provides the use of a macrophage or splenocyte cell derived from a non-human animal whose function of MyD88 is deficient on is chromosome as a model cell unresponsive to bacterial cell wall components.
As a method of measuring and assessing the macrophage activity level, the method of measuring and assessing the production amount of cytokine and/or nitrous ion in the macrophage is exemplified, and as a method of measuring and assessing the splenocyte activity level, a method of measuring and assessing the expression amount of MHC class II in the splenocyte is exemplified. In the measurement and the assessment of the macrophage activity level or the splenocyte activity level, it is preferable to assess the levels in comparison to the measured value of a wild type non-human animal, in particular, a littermate wild type non-human animal of the non-human animal being unresponsive to bacterial cell components as control, because there will be no dispersion caused by individual differences. This can be applied to the assessment of bioactivity of various subject materials and detection of bacterial cell components and the like, in which the non-human animal being unresponsive to bacterial cell components is used.
The relationship between IL-1 and the illness in disease model mice can be examined by precisely assessing IL-1 activity of a subject material with MyD88 knockout mice. It becomes possible to obtain useful information for developing pharmaceuticals which can cure diseases such as rheumatoid arthritis caused by overexpression of IL-1, a graft-versus-host disease, asthma and the like by precisely assessing IL-1 activity of a subject material and by analyzing the involvement of IL-1 in disease model mice. Examples of IL-1 activity as an object of assessment include mitogens such as phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (Con A) and the like, proliferation inducing activity of T cells caused by co-stimulation with IL-2 at a low concentration, and activity which induces the production of TNF-α, IL-1 and IL-6 by working on monocytes and macrophages.
Moreover, by precisely assessing IL-1 activity of a subject material with MyD88 knockout mice, it becomes possible to obtain useful information for developing pharmaceuticals which can cure diseases caused by overproduction of IL-18, such as I type diabetes, a graft-versus-host disease and the like. Examples of IL-18 activity as an object of assessment include activity which promotes production of IFN-γ, activity which enhances activity of NK cells, activity which induces production of IFN-γ from T cells in cooperation with IL-12, and action which activates IRAK or NF-κB.
The present invention provides the use of a non-human animal whose function of MYD88 is deficient on its chromosome, in a method of detecting bacterial cell components, which method comprises the steps of: (i) administering the subject material to a) an animal whose function of MYD88 is deficient on its chromosome, or cell derived therefrom and b) to a wild-type non-human animal or cell and (ii) assessing and comparing responsiveness to the subject material.
With the method of detecting the bacterial cell components, it is possible to detect insubstantial amount of bacterial cell components contained in subject materials in the non-human animal being unresponsive to bacterial cell components after the subject material has been administered to the non-human animal. The examples of such bacterial cell components include; a lipoprotein/lipopeptide derived from a cell component of bacteria which belong to Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia and the like; endotoxin derived from Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Vibrio cholerae, Salmonella minnesota, Porphyromonas gingivalis and the like; peptidoglycan derived from Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Nocardia coeliaca and the like; lipoteichoic acid derived from Streptococcus pneumoniae and the like; and whole cell lysates of Mycobacterium tuberculosis.
The present invention will be explained more specifically with examples below, but the technological scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 (Generation of MyD88 knockout mice)
A MyD88 gene was screened from a 129/SvJ mouse genomic library (Stratagene), subcloned into pBluescript vector (Stratagene), and characterized by restriction enzyme mapping and DNA sequencing. A targeting vector was constructed by replacing the 1.0 kb genomic fragment of the wild-type allele with a neomycin resistance gene from pMC1-neo (Stratagene). The replaced genomic fragment contained 2 exons encoding the domain that resembles the cytoplasmic domain of the IL-1RAcP (receptor accessory protein). The neomycin resistance gene was flanked by the 1.1 kb 5' genomic fragment and the 5.2 kb 3' fragment. Then,an HSV-tk cassette was introduced into the 3' end of the genomic fragment. E14.1 ES cells were transfected with the linearized targeting vector and selected with G418 and gancyclovir. Doubly resistant 176 clones were screened for homologous recombination by PCR and 33 clones were verified by Southern blot analysis using the probe indicated in Fig. 1.
Three independently identified targeted ES clones were microinjected into the blastocysts of C57BL/6 mice. Thus obtained chimeric mice were mated with C57BL/6 female mice to produce heterozygous mice. The Heterozygous mice were intercrossed to obtain homozygotes, and MyD88-deficient were born at the expected Mendelian ratios ( / : /-:-/- = 52:93:53) from the intercross. The MyD88 knockout mice of the present invention grew healthy and showed no obvious abnormalities until 20 weeks of age. Northern blot analysis was performed to confirm that the inactivation of the MyD88 gene was caused by mutation. MyD88 mRNA could not be detected in the liver and the spleen of the MyD88-deficient mice. Flow cytometric analysis of CD3, B220, CD4, and CD8 in thymus, spleen, and lymph node showed that lymphocyte composition was not altered in the MyD88 knockout mice in comparison with wild-type mice.
Example 2 (Unresponsiveness of MyD88 knockout mice to Endotoxin)
1mg of LPS derived from Escherichia coli (055:B5) was administered to 10 MyD88 knockout mice of the present invention, and endotoxin-unresponsiveness was examined through the survival ratio of the mice. 10 wild-type littermates were used as control. The results are shown in Fig. 2. It is confirmed by Fig. 2 that though the wild-type mice have responded to LPS and all of them died within 4 days after administration, none of the MyD88 knockout mice have died within 4 days after LPS administration, and that the mice are endotoxin-unresponsive.
Example 3 (Impaired IL-1-mediated functions in MyD88 knockout mice)
1 × 105 of thymocytes of the MyD88 knockout mice were cultured in 96-well plates for 72 hours with mixtures containing 2 µg/ml of phytohemagglutinin (PHA), which is a costimulant of IL-1 for T cell proliferation, 2.5 µg/ml of concanavalin A (ConA), or 2 ng/ml of IL-2 respectively, and 100 U/ml of IL-1β (Genzyme), and T cells were proliferated. Proliferation of T cells were examined by measuring [3H] amount of [3H] thymidine taken into the cells. As a result, thymocytes of wild-type littermates displayed enhanced proliferation when cultured with PHA, ConA or IL-2 in the presence of IL-β, however, thymocytes of the MyD88 knockout mice show almost no enhanced proliferation (see Fig. 3). It has been found that similar results could be obtained even when splenic B cells were used instead of thymocytes.
Further, thymocytes of MyD88 knockout mice were cultured with 10 ng/ml of phorbol 12-myristate 13-acetate paramethoxyamphetamine (PMA) or 2.5 µg/ml of Con A in the presence of 20 ng/ml of IL-2 (Genzyme) in a same manner as above-mentioned, and enhancement of proliferation was examined. There was no difference between thymocytes of MyD88 knockout mice and of wild-type littermates in their proliferation as to the reaction of IL-2 and PMA or Con A (see Fig. 3). These results indicate that IL-1-mediated growth signal of T cells was impaired in the thymocytes of MyD88 knockout mice.
MyD88 knockout mice were intravenously injected with 1 pg of IL-β (Genzyme), and 2 hours later liver and sera were taken. Total RNA was extracted from the liver using Trizol reagent (GIBCO). This RNA (10µg) was electrophoresed and transferred to a nylon membrane, then Northern blot analysis was conducted with 32P-labelled cDNA for acute phase proteins such as serum amyloid A (SAA-I), serum amyloid P(SAP), and haptoglobin (HP). In comparing IL-1-induced increase of mRNA expression in wild-type littermates and in MyD88 knockout mice, increase of induction was observed in wild-type mice, but not observed in MyD88 knockout mice.
Because IL-1 induces production of acute phase proteins such as tumor necrosis factor (TNF-α) or IL-6, and proinflammatory cytokines, increase of TNF-α and IL-6 concentrations in serum taken from MyD88 knockout mice of the present invention and wild-type littermates by the above-stated method were measured by ELISA. As a result, TNF-α and IL-6 concentrations increased by IL-1β in wild-type mice, while neither TNF-α nor IL-6 concentration increased by IL-1β in MyD88 knockout mice (see Fig.4).
Thus, IL-1-mediated major biological functions has been found to be severely impaired in MyD88 knockout mice.
Example 4 (Impaired IL-18-mediated functions in MyD88 knockout mice)
It has been well known that IL-18 enhances lytic activity of NK cells. Splenic B cells from MyD88 knockout mice and wild-type littermates were cultured in the presence or absence of 20 ng/ml of IL-18 (Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) for 24 hours with 51Cr-labelled mouse lymphoma cells (hereinafter "YAC-1") targeting cells. 4 hours later, released 51Cr in supernatants were counted by a gamma counter. As a result, when splenic B cells were cultured in the presence of IL-18 in vitro, lytic activity to YAC-1 targeting cells was dramatically enhanced in wild-type mice, but it was not enhanced in MyD88 knockout mice. When IL-2 was used instead of IL-18, lytic activity was also enhanced in splenic B cells of MyD88 knockout mice (see Fig.5).
Further, splenic B cells of MyD88 knockout mice and their wild-type littermates were stimulated by 20 ng/ml of IL-18 and cultured for 24 hours in vitro, then production of IFN-γ in culture supernatants was measured by ELISA. As a result, production of IFN-γ was induced in wild-type mice, however, production of IFN-γ was not observed in MyD88 knockout mice (see Fig.5).
Splenic T cells of MyD88 knockout mice and their wild-type littermates, which were purified to 95% or over, were cultured on anti-CD3 antibody (20 µg/ml)(PharMingen)-coated plates in the presence of 2 ng/ml IL-12. 4 days after the onset of culture; cells were harvested and washed with Hanks' balanced salt solution. The washed cells (2 × 105) were stimulated and cultured again on anti-CD3 antibody (20 µg/ml)-coated 96-well plates for 24 hours with 20 ng/ml of IL-18 or 2 ng/ml of IL-12. Concentration of IFN-γ in culture supernatants was determined by ELISA and compared. The result indicates that Splenic T cells of MyD88 knockout mice cannot enhance IL-18-responsive production of IFN-γ (see Fig.6).
MyD88 knockout mice and their wild-type littermates were intraperitoneally injected with 500 µg of heat-killed Propionibacterium acnes (P. acnes). Seven days after injection, T cells were purified from spleen, then cultured and stimulated on anti-CD3 antibody (20 µg/ml)-coated 96-well plates for 24 hours in the presence or the absence of 20 ng/ml of IL-18. Concentration of IFN-γ in culture supernatants was determined by ELISA. MyD88 knockout mice and their wild-type littermates were intravenously injected with 2 mg of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (Kyowa). 14 days after injection, T cells were purified from spleen, then cultured and stimulated for 24 hours, as described above, subsequently concentration of IFN-γ was measured. As a result, in both cases, high level of IFN-γ production in response to IL-18 was observed in wild-type mice, but production level of IFN-γ could not be enhanced in the presence of IL-18 in MyD88 knockout mice of the present invention (see Fig.6).
These results demonstrate that MyD88 knockout mice are defective in Th1 cell development in vivo as is the case with IL-18-deficient mice, and that their major biological activities mediated by IL-18 were completely abolished.
Next, it was examined whether the dominant negative MyD88 mutant blocked IL-18-induced NF-κB activation as well. COS-7 cells were transiently transfected with MyD88 (amino acid 152-296) expression vector together with NF-κB-dependent luciferase reporter gene, and luciferase activity after IL-18 treatment was measured. Coexpression of MyD88 blocked IL-18-induced activation almost completely (see Fig. 7).
Because IL-18 activates AP-1-dependent gene information, whether MyD88 (amino acid 152-296) also acted as a dominant negative mutant of IL-18-induced AP-1 activation was investigated. Stimulation with IL-18 induced an approximately 3- to 4-fold increase in AP-1 activity, and this activation was blocked by coexpression of MyD88 (amino acid 152-296) (see Fig. 7). These results show that MyD88 is involved in IL-18-induced activation of both NF-κB and AP-1.
Further, whether IL-18-induced activation of NF-κB was observed in MyD88-deficient cells was examined. Splenic T cells cultured in the presence of IL-12 and anti-CD3 antibody for 4 days were starved for 3 hours and then stimulated with IL-18. Nuclei extracted from the stimulated cells were analyzed by a gel mobility shift assay using a specific probe containing NF-κB binding site. IL-18-induced NF-κB DNA binding activity was detected in the nuclear extracts from wild-type cells but not from MyD88-deficient cells. On the other hand, treatment of wild-type or MyD88-deficient thymocytes with TNF-a resulted in almost the same levels of NF-κB DNA binding activity, demonstrating that the impaired IL-18-induced NF-κB activity in MyD88-deficient cells was not due to the abnormal function or impairment of regulating ability of NF-κB.
In addition to induction of NF-κB activation, IL-1 is also known to activate c-Jun N-terminal kinase (JNK). To test whether IL-18 induces JNK activation, an in vitro kinase assay was carried out using GST-c-Jun-fusion protein as a substitute. Treatment with IL-18 induced JNK activation in Th1-developing cells of wild-type mice. However, IL-18-induced JNK activation was not observed in MyD88-deficient cells. By contrast, normal activation of JNK was observed in MyD88-deficient cells treated with TNF-α. IL-18-induced NF-κB and JNK activation was impaired in MyD88-deficient mice. These results demonstrate that MyD88 is essential for IL-18-induced activation of both NF-κB and JNK.
Example 5 (Unresponsiveness of macrophages and splenic B cells of MyD88 knockout mice to bacterial cell wall components)
5-1 (Generation of TLR4-deficienct mice)
It has recently been reported that C3H/HeJ mice are hyporesponsive to LPS because of a missense point mutation in the Toll-like receptor(TLR)-4 gene (Science 282, 2085-8, 1998, J. Exp. Med. 189, 615-625, 1999, J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999), and the inventors have demonstrated that macrophages and splenic B cells of TLR4-deficient mice are hyporesponsive to LPS, and that TLR4 gene is essential for LPS signaling (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). In order to compare the responsiveness of macrophages and splenic B cells of TLR4- and MyD88-deficient mice to bacterial cell wall components, TLR4-deficient mice (F2 interbred from 129/01aXC57BL/6) were generated by gene targeting as described previously (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). Age-matched groups of wild-type, TLR4-, and MyD88-deficient mice were used for the following examples.
5-2 (Preparation of bacterial cell wall components)
LPS of Escherichia coli Serotype 055:B5 (Sigma), Klebsiella pneumoniae (Sigma), Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 (Sigma), Salmonella typhimurium (Sigma), Serratia marcescens (Sigma), Shigella flexneri Serotype 1A (Sigma) and Vibrio cholerae Serotype Inaba 569B (Sigma) and the like were purchased. They were prepared by phenol extraction and purified by gel filtration. LPS from Salmonella minnesota Re-595 prepared by phenol-chloroform-petroleum ether extraction procedure was also purchased (Sigma). LPS and Lipid A of Porphyromonas gingivalis 381 was prepared by the method as described previously (FEBS Lett. 332, 1994, 197-201). Whole cell lysates of Mycobacterium tuberculosis was prepared by the following process: Mycobacterium tuberculosis Aoyama B strain (NIHJ 1635) was cultured in Dubos broth (DIFCO) for 1 month; cells were collected and resuspended with phosphate buffered saline (PBS); cells were sonicated.
5-3 (Preparation of peritoneal macrophages)
2 ml of 4% thioglycollate was intraperitoneally injected into the generated wild-type, TLR4- and MyD88-deficient mice respectively. Three days later, peritoneal exudate cells were isolated from the peritoneal cavity and washed with ice-cold Hank's buffered salt solution (HBSS), then peritoneal cells were obtained. The cells were made to float in RPMI1640 medium, then put in plastic plates separatedly, and cultured for 2 hours at 37°C and washed with Hank's buffered salt solution to remove nonadherent cells. Adherent cells were used as peritoneal macrophages in the experiments bellow.
5-4 (Unresponsiveness to LPS of Salmonella minnesota Re-595)
Responsiveness of each peritoneal macrophage of the wild-type (wild-type), TLR4-deficient (TLR4-/-), MyD88-deficient (MyD88-/-) mice and the like to LPS were examined with LPS of Salmonella minnesota Re-595. Peritoneal macrophages from each mouse were cultured for 24 hours in the presence of various concentrations (0, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 µg/ml) of LPS and stimulated, then concentration of tumor necrosis factor (TNF-α) released from LPSs-responsive macrophages was measured by ELISA (see Fig. 8A). By these results, it has been found that production of TNF-α increases in response to LPS in a dose-dependent manner in macrophages of wild-type mice, by contrast, no production of TNF-α is observed in TLR4- or MyD88-deficient mice even when they receive LPS stimuli at a concentration of 100 µg/ml, and that these mice are LPS-unresponsive.
Further, responsiveness of splenic B cells to LPS of Salmonella minnesota Re-595 was examined. Splenic B cells (1 x 105) of each of the wild-type, TLR4- and MyD88-deficient mice were isolated, cultured in 96-well plates and stimulated by various concentrations (0, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 µg/ml) of LPS. 1 µCi of [3H]-thymidine (DuPont) was added 40 hours after onset of the culture, then the cells were cultured for another 8 hours, and [3H] uptake was measured by a β scintillation counter (Packard) (see Fig. 8B) . As a result, LPS-induced proliferative response was promoted in response to LPS in a dose-dependent manner in splenic B cells of wild-type mice, by contrast, no LPS-induced proliferative response was observed in splenic B cells of both TLR4- and MyD88-deficient mice.
The expression of major histocompatibility complex (MHC) class II (I-Ab molecule) on the surface of splenic B cells in response to Re-595 LPS was examined by flow cytometry. Splenic B cells (1 × 106) from each of the wild-type, MyD88-and TLR4-deficient mice were cultured for 48 hours in the presence of various concentrations (0, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 µg/ml) of LPS. After the culture, the cells were collected and then stained by combining I-Ab molecule on the surface of the cells and FITC-labelled antibody which is constructed by combining phycoerythrin (PE; PharMingen)-conjugated anti-B220 antibody or biotinylated anti-mouse I-Abantibody (PharMingen) and fluorescein isocyanate (FITC; PharMingen)-conjugated streptavidin. The stained cells were analyzed on fluorescence-activated cell sorter Calibur (FACS Calibur) using CELLQuest software (Becton Dickinson). As a result, Re-595 LPS caused an increase in the expression of I-Ab molecule on the surface of splenic B cells of wild-type mice. In contrast, Re-595 LPS did not enhance I-Ab molecule expression in splenic B cells of either TLR4- or MyD88-deficient mice, even when stimulated with high concentration of LPS (100 µg/ml)(see Fig. 8C). The above-mentioned results indicate that both TLR4- and MyD88-deficient mice are unresponsive to LPS of Salmonella minnesota Re-595.
5-5 (Responsiveness of TLR4- and MyD88-deficient mice to IL-4 and IFN-γ)
In order to examine whether splenic B cells of TLR4- and MyD88-deficient mice are unresponsive to all stimuli, the responsiveness of splenic B cells of TLR4- and MyD88-deficient mice to other stimuli were investigated. The investigation demonstrates that there was no impairment as to their responsiveness to the stimuli as described below, and that these mice were specifically defective in their response to LPS.
Splenic B cells (1 × 105) from each of the wild-type, MyD88- and TLR4-deficient mice were isolated, cultured for 40 hours in the presence of both IL-4 (Genzyme) and anti-IgM antibody, or in the presence of anti-CD40 antibody, then [3H]-thymidine (DuPont) was added and the cells were cultured for another 8 hours, and [3H] uptake was measured by a β scintillation counter (see Fig. 9A). As a result, splenic B cells of both TLR4- and MyD88-deficient mice showed same reaction as splenic B cells of wild-type mice with regard to the response to IL-4 and the mixture of anti-IgM antibody, or to the anti-CD40 antibody.
Next, Splenic B cells (1 × 106) from each of the wild-type, MyD88- and TLR4-deficient mice were cultured for 48 hours in the presence or absence of 100 U/ml of IL-4, and then stimulated. Subsequently, the cells were stained by combining I-Ab molecule on the surface of the splenic B cells and PE-conjugated anti-B220 antibody or FITC-conjugated anti-mouse I-Ab antibody. The cell proliferation was measured on fluorescence-activated cell sorter Calibur using CELLQuest software (see Fig. 9B). As a result, splenic B cells of both TLR4- and MyD88-deficient mice showed same reaction as those of wild-type mice with regard to the response to IL-4 as well.
Each of wild-type, MyD88- and TLR4-deficient mice were intraperitoneally injected with 5000 U of IFN-γ (Genzyme) or PBS. Three days after injection, peritoneal macrophages were collected and stained by combining I-Ab molecule on the surface of the macrophage membranes and FITC-conjugated anti-mouse I-Abantibody, then analyzed by fluorescence-activated cell sorter Calibur using CELLQuest software (see Fig. 9C). The result indicated that the expression of I-Ab molecule in peritoneal macrophages, in other words, blockage level of IFN-induced cell proliferation was comparative among wild-type, MyD88- and TLR4-deficient mice.
5-6 (Analysis of phagocytosis)
Macrophages of wild-type, MyD88- and TLR4-deficient mice added with 0.025 % of fluorescent latex beads (0.75 µm) (Polyscience) were cultured for 2 hours at 37°C in a CO2 incubater. Then the culture materials were washed vigorously three times with PBS to remove non-phagocytosed beads and incubated with PBS containing 2.5 % of formaldehyde for 20 minutes, and fixed with formaldehyde. Visualization of these fixed cells with Axiophoto microscope (Carl Zeiss, Inc.) showed that peritoneal macrophages of both TLR4- and MyD88-deficient mice phagocytosed the latex particles, and therefore, that phagocytic ability of the macrophages of TLR4-and MyD88-deficient mice were not impaired by these other stimuli.
5-7 (Responsiveness to LPS of Porphyromonas gingivalis)
As LPS of Porphyromonas gingivalis shows some reaction in its ability to activate cells of LPS-hyporesponsive C3H/HeJ mice (J. Immunol. 158, 1997, 4430-6), responsiveness of each mouse to LPS of Porphyromonas gingivalis was examined as in the case with Salmonella minnesota Re-595. In macrophages of wild-type mice, TNF-α was induced in response to LPS of Porphyromonas gingivalis in a dose-dependent manner. However, macrophages of TLR4-deficient mice were hyporesponsive like those of C3H/HeJ mice, and only showed the TNF-α producibility which was about one third of that of wild-type mice macrophages. In contrast, macrophages of MyD88-deficient mice did not produce any detectable TNF-α, even when stimulated with high concentration of LPS (see Fig. 10A).
Splenic B cells of TLR4-deficient mice exhibited low level proliferative response to LPS of Porphyromonas gingivalis 381, and enhanced the expression of I-Ab molecule of splenic B cells, however, splenic B cells of MyD88-deficient mice did not exhibit proliferative response and the expression of I-Ab molecule could not confirmed (see Fig. 10B and C). Further, the same results were obtained with lipid A of Porphyromonas gingivalis 381. This indicates that TLR4-deficient mice are hyporesponsive and MyD88-deficient mice are unresponsive to LPS of Porphyromonas gingivalis. In addition, it has been found that MyD88 is essential for the signaling induced by LPS of Porphyromonas gingivalis, whereas TLR4 shows partial contribution.
5-8 (Responsiveness to LPS of Escherichia coli 055:B5)
Responsiveness to LPS of Escherichia coli 055:B5 was examined as in the case with Salmonella minnesota Re-595. The responsiveness to LPS of Escherichia coli (055:B5) was impaired in peritoneal macrophages of both TLR4- and MyD88-deficient mice, compared with those of wild-type mice (Fig. 11A). However, when stimulated with high concentration of LPS, macrophages of TLR4-deficient mice produced a small amount of TNF-α. In contrast, macrophages of MyD88-deficient mice did not produce TNF-α even when stimulated with high concentration of LPS.
Similar tendencies were observed in proliferative responses in splenic B cells of these mice (see Fig. 11B). Furthermore, when stimulated with LPS at a concentration over 10 µg/ml, splenic B cells of TLR4-deficient mice showed a certain expression level of I-Ab molecule similar to the level shown by splenic B cells of wild-type mice. In contrast, splenic B cells of MyD88-deficient mice did not show I-Ab molecule expression even when stimulated with LPS at a concentration of 100 µg/ml (see Fig. 11C). As in the case of stimuli with LPS of Porphyromonas gingivalis, these results indicate that TLR4-deficient mice are hyporesponsive and MyD88-deficient mice are unresponsive to LPS of Escherichia coli (055:B5).
5-9 (Responsiveness to peptidoglycan)
It has been reported that Peptidoglycan (PGN), which is a major cell wall component of Gram-positive bacteria, activates macrophages (J. Immunol. 155, 1995, 2620-30, Infect. Immun. 62, 1994, 2715-21). Therefore, responsiveness to PGN of Staphylococcus aureus (Fluka) was examined as in the case with Salmonella minnesota Re-595. When stimulated with PGN, peritoneal macrophages of TLR4-deficient mice produced TNF-α in a dose-dependent manner to almost the same extent as macrophages of wild-type mice. In contrast, macrophages of MyD88-deficient mice did not produce TNF-α even when stimulated with high concentration of PGN (see Fig. 12A).
When stimulated with PGN of Staphylococcus aureus, splenic B cells of wild-type mice displayed proliferative responses, and the proliferative response was severely impaired in peritoneal macrophages of MyD88-deficient mice compared with those of wild-type mice, but in TLR4-deficient mice, the proliferative response was not severely impaired as in MyD88-deficient mice (see Fig. 12B). Further, when stimulated with PGN at a concentration over 10 µg/ml, splenic B cells of TLR4-deficient and wild-type mice showed enhancement of I-Ab molecule expression. In contrast, splenic B cells of MyD88-deficient mice did not show enhancement of I-Ab molecule expression even when stimulated with PGN at a concentration of 100 µg/ml (see Fig. 12C). Thus, TLR4-deficient mice showed almost the same response to PGN of Staphylococcus aureus as wild-type mice, while MyD88-deficient mice showed no responsiveness.
5-10 (Responsiveness to lipoteichoic acid)
As lipoteichoic acid (LTA) is a cell wall component of Gram-positive bacteria and induces activation of monocytes and macrophages (Infect. Immun. 62, 1994, 2715-21), responsiveness to LTA of Streptococcus pneumoniae was examined as in the case with Salmonella minnesota Re-595. Peritoneal macrophages of wild-type mice increased production of TNF-α in response to LTA in a dose-dependent manner. In contrast, macrophages of MyD88-deficient mice did not produce TNF-α even when stimulated with high concentration of LTA. In comparison with peritoneal macrophages of wild-type mice, TNF-α production was also impaired in those of TLR4-deficient mice, however, TNF-α was induced when stimulated with 100 µg/ml of LTA (see Fig. 13A) .
Next, proliferative responses and enhancement of I-Ab molecule expression in splenic B cells of these mice in response to stimulation from LTA of Streptococcus pneumoniae was analyzed (see Fig. 13B). The results indicated that splenic B cells of wild-type mice enhanced their response to LTA in a dose-dependent manner, whereas splenic B cells of MyD88-deficient mice exhibited a severely defective proliferative response to LTA. Though splenic B cells of TLR4-deficient mice also exhibited an impaired proliferative response, they exhibited proliferative response when stimulated with high concentration of LTA. Further, in splenic B cells of wild-type and TLR4-deficient mice, enhancement of I-Ab molecule expression was also observed on the cell surface, whereas no enhancement was observed in those of MyD88-deficient mice (see Fig. 13C). This indicates that MyD88-deficient mice are unresponsive to stimulation from LTA of Streptococcus pneumoniae.
5-11 (Responsiveness to whole cell lysates of Mycobacterial tuberculosis)
As cell wall components of Mycobacterial tuberculosis, especially lipoarabinomannan, are known to induce activation of myeloid cells (J. Immunol. 149, 1992, 541-7, J. Clin. Invest. 91, 1993, 2076-83), responsiveness to whole cell lysates of Mycobacterial tuberculosis was examined as in the case with Salmonella minnesota Re-595. Macrophages of wild-type mice produced TNF-α in response to the whole lysates in a dose-dependent manner. Macrophages of TLR4-deficient mice also exhibited TNF-α production though the production amount was smaller than those of wild-type mice. However, macrophages of MyD88-deficient.mice did not produce TNF-α in response to the whole cell lysates of Mycobacterial tuberculosis at a high concentration (see Fig. 14A).
Next, responsiveness of these mice to stimulation from whole cell lysates of Mycobacterial tuberculosis was examined. Splenic B cells of wild-type mice exhibited enhancement of proliferative responses and I-Abmolecule expression on the surface of the cells in response to the whole cell lysates in a dose-dependent manner. Splenic B cells of TLR4-deficient mice also showed proliferative responses and I-Ab molecule expression, although these responses were lower than those of splenic B cells of wild-type mice. In contrast, splenic B cells of MyD88-deficient mice displayed severely impaired proliferative responses and enhancement of I-Ab molecule expression, indicating that they are unresponsive to the whole cell lysates (see Fig. 14B and C).
5-12 (Responsiveness to other bacterial cell wall components)
Responsiveness of wild-type, TLR4- and MyD88-deficient mice to other bacterial cell wall components [LPSs of Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 10, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Vibrio cholerae and the like, and PGN of Staphylococcus epidermidis, which is provided from Shigeo Kawata of Dainippon Pharmaceutical Co.] was examined in a same manner as aforementioned. The results are shown in Table 1. This Table 1 shows that MyD88-deficient mice are unresponsive to all bacterial cell components.
Table 1
Sample Responsiveness of mice
LPS wild-type TLR4-/- MyD88-/-
Escherichia coli 055:B5 -
Klebsiella pneumoniae - -
Porphyromonas gingivalis -
Pseudomonas aeruginosa -
Salmonella minnesota Re595 - -
Salmonella typhimurium -
Serratia marcescens -
Shigella flexneri -
Vibrio cholerae -
PGN
Staphylococcus aureus -
Staphylococcus epidermidis -
LTA
Streptococcus faecalis -
whole cell lysates of Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis -
It has been found that LPS can be classified into two types: one type includes LPSs which utilize TLR4 as their unique signaling receptor and show unresponsiveness (LPSs of Salmonella minnesota Re595, Klebsiella pneumoniae and the like); another type includes LPSs which show hyporesponsiveness to TLR4-deficient mice (LPSs of Porphyromonas gingivalis, Escherichia coli 055:B5, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae and the like). Since MyD88-deficient mice show no responsiveness to these latter LPSs, it is presumed that the recognition and signaling of these LPSs are mediated by both TLR4 and other TLRs, and/or by TLR-related receptors that use MyD88 as an adaptor molecule.
Example 6 (Generation of TLR2 knockout mice - for reference only)
TLR2 gene was screened from 129/SvJ mouse genomic library (Stratagene) using a probe derived from a mouse EST clone (accession number D77677) similar to human TLR2 gene, and subcloned into pBluescript vector (Stratagene), then characterized by restriction enzyme mapping and DNA sequencing. A targeting vector was constructed by replacing a gene fragment at an exon region 1.3 kb containing cytoplasmic domain of TLR2 gene with pMC1-neo (Stratagene) having Poly A signal. The targeting vector was flanked by a 4.8 kb 5' genomic fragment and a 1.0 kb 3' fragment and contained an HSV-tk cassette at the 5' terminal. The targeting vector was linearized with SalI and electroporated into E14.1 embryonic stem cells (ES cells). 120 clones resistant to G418 and gancyclovir were screened for homologous recombination by PCR and 9 clones were confirmed by Southern blot analysis using the probe indicated in Figure 15A.
Chimeric mice were generated by microinjection of 3 targeted ES clones containing a homologously recombined mutant TLR2 allele into blastocysts of C57BL/6 mice. Male chimeric mice were bred to C57BL/6 females to produce heterozygous mice. The heterozygous mice were intercrossed to obtain homozygotes (Fig 15B). TLR2-deficient mice could be generated at the expected Mendelian ratio, and did not show any obvious abnormality until 20 weeks.
To confirm that the homologous recombination caused inactivation of the TLR2 gene, total RNA (15 pg) was extracted from peritoneal macrophages (5 × 106) of wild-type ( / ) and TLR2 knockout (-/-) mice and then electrophoresed, transferred to a nylon membrane, and Northern blot analysis was conducted using cDNA specific to [32P] -labelled TLR2, or cDNA specific to GAPDH (glycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase) as the method previously described (Immunity 9, 143-150, 1998). As a result, TLR2 mRNA was not detected in peritoneal macrophages of TLR2-deficient mice (Fig 15C). In addition, it was shown that the expressions of CD3, B220, CD4, and CD8 in thymocytes and splenocytes of TLR2 knockout mice were not different from those of wild-type mice (data not shown).
Example 7 (Responsiveness of TLR2 knockout mice to endotoxin - for reference only)
1 mg of LPS derived from Escherichia coli (055:B5) was injected into each of TLR2 knockout mice (n=5), TLR4 knockout mice (n=5) and wild-type mice (n=5), and LPS unresponsiveness was examined by their survival rate. The results are shown in Fig. 16. Fig. 16 confirms that though TLR2 knockout mice (TLR2-/-) and wild-type mice responded to LPS and almost all of them died within 4 days after injection, none of TLR4 knockout mice (TLR4-/-) died even after 6 days after injection, and that TLR4 knockout mice are unresponsive to endotoxin.
Example 8 (Responsiveness of TLR2 knockout mice to cell components of Gram-negative bacteria - for reference only)
Each of TLR2 knockout (TLR2-/-), TLR4 knockout (TLR4-/-) and wild-type (wild-type) mice were intraperitoneally injected with 2 ml of 4% thioglycollate medium (DIFCO). Three days later, peritoneal exudate cells were isolated from the peritoneal cavity of each mouse. These cells were cultured in RPMI1640 medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum (GIBCO) for 2 hours at 37°C and washed with ice-cold Hank's buffered salt solution (HBSS; GIBCO) to remove nonadherent cells. Adherent cells were used as peritoneal macrophages for following experiments.
Each of obtained peritoneal macrophages were cultured for 24 hours with 1.0 ng/ml of synthetic lipid A derived from Escherichia coli (compound 506; Daiichi Pure Chemicals) or LPS derived from Salmonella minnesota Re-595 (Sigma) in the presence or absence of IFN-γ (30 unit/ml). Synthetic lipid A, which was soluble in endotoxin-free water and containing 0.025% of triethylamine, was used as said synthetic lipid A. After the culture, production amounts of IL-6 (Fig. 17A), TNF-α (Fig. 17B) and NO2- (Fig. 17C) in culture supernatants were measured. Production amount of IL-6 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA; ENDOGEN), and that of TNF-α was measured by ELS
Traduzione - Italiano Titolo: Topo knockout MyD88 come modello animale non reattivo verso componenti della parete di cellule batteriche
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Descrizione
Campo della tecnica
La presente invenzione riguarda usi di modelli animali non umani che sono non reattivi verso componenti della parete di cellule batteriche. Il componente della parete di cellule batteriche può essere una lipoproteina / lipopeptide, che è un componente cellulare di batteri che appartengono a Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia o similari. Il componente della parete di cellule batteriche può essere un peptidoglicano, che è una frazione della parete cellulare di batteri Gram-positivi. In alternativa, il componente della parete di cellule batteriche può essere endotossina, che è una frazione della parete cellulare di batteri Gram-negativi.
Stato della tecnica
Le citochine sono trasmettitori di segnali intracellulari che svolgono un ruolo importante in una risposta immune, nella risposta successiva ad un'infezione, nell'ematopoiesi, nell'inibizione di una infezione virale e di cellule tumorali. Tra loro, una citochina che trasmette segnali tra linfociti prende il nome di interleuchina (in seguito "IL"). Tra le IL, IL-1 è una citochina che media varie risposte immuni e risposte infiammatorie, è coinvolta nel mantenimento dell'omeostasi di organismi viventi, ed è prodotta da varie cellule, come monociti, macrofagi, cheratinociti, cellule dell'endotelio vascolare e similari, quando gli organismi viventi rimangono infettati o feriti. È risultato noto che esistono due tipi di IL-1, IL-1α e IL-1β, entrambe le quali si combinano con lo stesso recettore. È risultato inoltre noto che IL-1 esercita la sua funzione in concomitanza all'attivazione da parte di un antigene per una cellula T e da parte di mitogeni, induce il rilascio di IL-2 da parte delle cellule T, potenzia l'espressione di recettori di IL-2 allo scopo di indurre la proliferazione di cellule T, e agisce su monociti e macrofagi per indurre la produzione di TNF-α, IL-1, IL-6.
IL-1 ha due tipi di recettori di IL-1 (in seguito "IL-1R"), e i due IL-1R, di tipo I e di tipo II, hanno tre domini immunoglobulina-simili nei loro domini extracellulari. I recettori di tipo I si esprimono in cellule T e tessuto connettivo, mentre i recettori di tipo II si esprimono in cellule B spleniche, mieloidi e similari, ed è risultato noto che i recettori di tipo I inducono NF-κB nei nuclei. È risultato inoltre noto che esiste un antagonista dei recettori di IL-1 (in seguito "IL-1ra") che non mostra alcuna bioattività, nonostante si leghi a IL-1R con l'affinità simile a quella di IL-1α e IL-1β, e che impedisce ad IL-1 di legarsi ad IL-1R in modo competitivo.
IL-18 è nota per promuovere la produzione di interferone-γ (in seguito "IFN-γ"), potenziando l'attivazione di cellule natural killer, inducendo la produzione di IFN-γ da cellule T in cooperazione con IL-12, e svolgendo un ruolo importante in una risposta a Th1 (IL-2 producendo cellule T helper). È inoltre noto che IL-18 non ha somiglianza strutturale con IL-12, nonostante abbia una somiglianza funzionale, e ha una somiglianza strutturale con IL-1. È risultato inoltre noto che IL-18 è prodotta come precursore inattivo che richiede una scissione da enzima di conversione della IL-1β (ICE)/caspasi-1 per la sua maturazione, come nel caso di IL-1β, e che IL-18 attiva una chinasi associata a IL-1R (IRAK) e NF-κB.
Fino ad ora è stata identificata una pluralità di molecole esibenti omologia a IL-1R, e vie di segnale mediate dalla famiglia di IL-1R sono ora studiate in modo intensivo. È risultato noto che MyD88 è una proteina citoplasmatica costituita da un dominio omologo a IL-1R e da un dominio Death, e funge da molecola adattatrice che attiva NF-κB reclutando IRAK nel complesso di IL-1R dopo stimolazione di IL-1, e che il gene MyD88 è stato originariamente separato come un gene di risposta primaria del differenziamento mieloide, che induce rapidamente cellule mieloleucemiche M1 a macrofagi mediante differenziamento stimolato con IL-6.
Le tossine in cellule batteriche costituite da un lipopolisaccaride, che è un componente strutturale principale della membrana esterna comprendente un peptidoglicano sulla superficie di batteri Gram-negativi, sono chiamate endotossine, ed è risultato noto che un lipopolisaccaride è costituito da un lipide chiamato lipide A e vari tipi di saccaride che si legano in modo covalente al lipide A. È risultato inoltre noto che questa endotossina ha una bioattività coinvolta principalmente in febbre, diminuzione di leucociti e piastrine, necrosi emorragica di cellule di midollo osseo, ipoglicemia, induzione di IFN, attivazione di un linfocita B (cellula della risposta immune derivata dal midollo), e similare.
È risultato noto che un gene Toll è richiesto per controllare il modellamento dorsoventrale durante lo sviluppo embrionale di Drosophila (Cell 52, 269-279,1988, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996), e per risposte immuni antifungine in una mosca adulta (Cell 86, 973-983, 1996). È stato chiarito che il Toll è un recettore transmembrana di tipo I con un dominio extracellulare contenente una ripetizione ricca di leucina (LRR) e che il suo dominio mostra un'elevata omologia a quello del recettore di interleuchina 1 (IL-1R) di mammifero (Nature 351, 355-356, 1991, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996, J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998). È stato inoltre chiarito che un altro elemento della famiglia di Toll, 18-wheeler, prende parte alla difesa dell'ospite antibatterico ma non alla risposta immune antifungina, e che patogeni particolari inducono risposte immune antimicrobiche specifiche in Drosophila attraverso l'attivazione selettiva delle vie di Toll (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14614-14619, 1997, EMBO J. 16, 6120-6130, 1997, Curr. Opin. Immunol. 11, 13-18, 1999).
Sono stati recentemente identificati omologhi di Toll di mammifero, indicati come recettori simili a Toll (TLR), e finora sono state riportate sei famiglie comprendenti TLR2 e TLR4 (Nature 388, 394-397, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998, Blood 91, 4020-4027, 1998, Gene 231, 59-65, 1999). È risultato noto che le famiglie di TLR, come nel caso del IL-1R, reclutano una chinasi associata a IL-1R (IRAK) attraverso la proteina adattatore MyD88 come un trasmettitore di segnale e attivano TRAF 6, e quindi attivano NF-κB a valle (J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998, Mol. Cell 2, 253-258, 1998, Immunity 11, 115-122, 1999). Il ruolo delle famiglie di TLR nei mammiferi è inoltre ritenuto prendere parte ad un riconoscimento immune innato come recettori di riconoscimento di modelli (PRR), che riconoscono strutture comuni di cellule batteriche (Cell 91, 295-298, 1997).
È stato riportato che uno di tali modelli molecolari patogeno-associati (PAMP) da essere riconosciuto dai PRR è lipopolisaccaride (LPS), un componente principale della membrana esterna di batteri Gram-negativi (Cell 91, 295-298, 1997), che detto LPS stimola cellule ospiti e fa loro produrre varie citochine proinfiammatorie comprendenti TNF-α, IL-1, e IL-6 (Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979, Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995), e che il LPS catturato da una proteina di legame al LPS (LBP) viene distribuito a CD14 sulla superficie cellulare (Science 249, 1431-1433, 1990, Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995). Tuttavia, dato che CD14 è una proteina fissata a glicosilfosfatidilinositolo (GPI) senza un dominio transmembrana, è stata ritenuta l'esistenza di un recettore di segnalazione in buona fede di LPS.
TLR4, che appartiene alla famiglia di TLR, è una molecola di segnalazione di LPS, che è un componente di cellule batteriche di batteri Gram-negativi, e la trasfezione del TLR4 porta ad una bassa attivazione costitutiva di NF-κB (J. Exp. Med. 188, 2091-2097, 1998, Nature 395, 284-288, 1998). D'altra parte, dato che TLR2 trasmette un segnale di LPS quando sovraespresso in cellule 293 epatiche embrionali umane in vitro, TLR2 è stato ritenuto essere un candidato per il recettore di LPS. In aggiunta, il gruppo di Godawski ha riportato che il TLR2 umano potrebbe interagire con CD14 per formare il complesso del recettore di LPS (J. Immunol. 163; 639-643, 1999). Un trattamento di stimolazione con LPS porta ad una oligomerizzazione di recettori e ad un successivo reclutamento di IRAK al complesso del recettore. Per contro, gruppi di Poltorak e Qureshi hanno riportato che TLR4 è il gene causativo dell’iporeattività dei topi C3H/HeJ nei confronti di LPS, ovvero il gene Lps secondo una clonazione posizionale (Science 282, 2085-2088, 1998, J. Exp. Med. 189, 615-625, 1999).
Gli inventori della presente invenzione hanno trovato dalla generazione di topi carenti di TLR4 che TLR4 è realmente coinvolto nella segnalazione di LPS (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). Le scoperte possono essere attribuite a differenze specie-specifiche nella struttura primaria di TLR, in altre parole la segnalazione di LPS potrebbe essere mediata da TLR4 nei topi e da TLR2 negli esseri umani. Esiste tuttavia un rapporto che mostra che anche il TLR2 murino ha attivato NF-κB in risposta a LPS (J. Immunol. 162, 6971-6975, 1999). In aggiunta, Chow et al. hanno riportato di aver ottenuto il risultato che mostra che il TLR4 umano ha attivato un'espressione genica mediata da NF-κB mediante stimolazione a LPS/CD14 in maniera dose-dipendente o tempo-dipendente, che è coerente con l'osservazione di topi C3H/HeJ, mentre hanno ottenuto il risultato in conflitto con quello del gruppo di Kirschning quando sono state usate cellule 293 umane, ed hanno speculato che le differenze di esito possono anche essere dovute alle differenze di lotto delle cellule 293 (J. Biol. Chem. 274, 10689-10692, 1999).
È stato recentemente riportato che TLR2 può non essere coinvolto esclusivamente nella reattività nei confronti di LPS derivata da batteri Gram-negativi (J. Immunol. 162, 6971-6975, 1999) ma può anche fungere da recettore di segnalazione per peptidoglicano (PGN) e acido lipoteicoico (LTA) da batteri Gram-positivi, che hanno un altro modello strutturale batterico comune (J. Biol. Chem. 274, 17406-17409, 1999, J. Immunol. 163, 1-5, 1999). Inoltre, è stato anche riportato che batteri Gram-positivi interi, PGN solubile, e LTA hanno indotto l'attivazione di NF-κB in cellule 293 esprimenti TLR2, ma non hanno indotto l'attivazione di NF-κB nelle cellule esprimenti TLR1 o TLR4 (J. Biol. Chem. 274, 17406-17409, 1999). Inoltre, è stato anche riportato che cellule fibroblastiche ovariche di criceto cinese (CHO, Chinese hamster ovary) che esprimono TLR2 umano ma non TLR4 sono state attivate in modo analogo da Staphylococcus aureus ucciso al calore e Streptococcus pneumoniae, e PGN derivato da Staphylococcus aureus (J. Immunol. 163, 1-5, 1999).
I micoplasmi, noti come patogeni in animali ed esseri umani, sono batteri senza parete, tuttavia sono in grado di attivare macrofagi. Numerosi rapporti hanno identificato questo materiale di attivazione dei macrofagi come lipoproteine/lipopeptidi, e uno di questi lipopeptidi, il lipopeptide di attivazione dei macrofagi 2kD MALP-2 derivato da Micoplasma fermentans, è stato completamente caratterizzato dal punto di vista biochimico ed è diventato disponibile tramite sintesi (J. Exp. Med. 185:1951, 1997). È noto che la porzione lipidica ha 2 atomi di C asimmetrici, e che il MALP-2 sintetico costituito dal racemato S, R aveva un'attivazione specifica simile all'azione di composti naturali a concentrazioni picomolari in vitro. Poco è noto riguardo alle vie segnale o i recettori di superficie cellulare per MALP-2, eccetto per il fatto che MALP-2 attiva NF-κB.
È riportato che lipoproteine/lipopeptidi da Mycobacterium e Borrelia burgdorferi hanno indotto l'attivazione di cellule ospiti attraverso TLR2 in vitro (Science 285, 736-739, 1999, Science 285, 732-736, 1999). Nondimeno, le conclusioni ottenute dagli esperimenti di sovraespressione non riflettono necessariamente la funzione della famiglia di TLR in vivo. È inoltre riportato che i risultati dell'analisi della reattività in base all'attivazione di NF-κB non sono correlati alle risposte biologiche mediate da questi stimoli (Infect. Immun. 66, 1638-1647, 1998).
In aggiunta, è noto che la funzione di un gene specifico può essere analizzato a livello individuale usando topi transgenici in cui i geni vengono introdotti ed espressi artificialmente, e i topi carenti del gene generati dalla localizzazione genica in cui geni specifici sono trasformati su genomi sono trasformati artificialmente mediante ricombinazione omologa con cellule staminali embrionali (in seguito "cellule ES"). In generale, topi carenti del gene sono chiamati "topi knockout" e topi knockout TLR2 e topi knockout MyD88 non sono risultati noti, ed inoltre, non è risultato noto neanche che topi knockout TLR2 e topi knockout MyD88 siano non reattivi verso componenti di cellule batteriche.
Riepilogo dell'invenzione
Sebbene si ritenga che le risposte in vivo verso componenti di cellule batteriche varino a seconda della differenza di livelli di espressione di ciascun TLR sulla superficie cellulare, resta da chiarire il contributo di elementi individuali della famiglia di TLR e di MyD88, la proteina adattatore della famiglia di TLR, alla segnalazione esercitata da stimoli di componenti di cellule batteriche in vivo. Uno scopo della presente invenzione è fornire l'uso di un animale non umano la cui funzione del gene MyD88 sia carente sul suo cromosoma, come un modello animale non reattivo verso componenti della parete di cellule batteriche. Tali animali sono utili per chiarire il contributo di MyD88, la proteina adattatore della famiglia di TLR, alla segnalazione esercitata da stimoli di componenti di cellule batteriche in vivo, in particolare, il ruolo di MyD88 in vivo.
Per conseguire lo scopo, gli inventori della presente invenzione hanno condotto uno studio intensivo. Essi hanno generato topi carenti del gene MyD88 nel seguente modo: una regione dell'esone comprendente due regioni dell'esone codificanti per la porzione C-terminale di MyD88 sono sostituite con il gene resistente alla neomicina, rispettivamente, mediante ricombinazione omologa con vettori plasmidici in cellule ES e il gene HSV-tk è stato indotto in ciascun lato C-terminale rispettivamente, e cloni di cellula ES doppiamente resistenti di G418 e ganciclovir sono stati sottoposti a screening; i cloni di cellule ES sono stati microiniettati in blastocisti di topi C57BL/6; topi knockout MyD88, la cui funzione del gene MyD88 è carente sui loro cromosomi, sono nati attraverso il germinale ai rapporti mendeliani attesi. Gli inventori hanno quindi scoperto che quei topi knockout MyD sono topi transgenici che crescono sani e non esibiscono anomalie evidenti fino alle 20 settimane di età, e che quei topi knockout MyD sono non reattivi nei confronti di un peptidoglicano, che è un componente di una parete cellulare di batteri Gram-positivi e nei confronti di lipoproteina/lipopeptide ed altri tali componenti di cellule batteriche, e la presente invenzione è così completata.
La presente invenzione riguarda l'uso di un animale non umano la cui funzione del gene MyD88 è carente sul suo cromosoma, come un modello animale non reattivo verso componenti della parete di cellule batteriche (rivendicazione 1). L'animale non umano può essere un roditore (rivendicazione 3) od un topo (rivendicazione 4).
La presente invenzione riguarda anche l'uso di una cellula di macrofago o di splenocita derivata da un animale non umano, come definito in qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, come un modello di cellula non reattivo verso componenti della parete di cellule batteriche (rivendicazione 4).
La presente invenzione può essere usata per chiarire i meccanismi di azione di componenti di cellule batteriche (rivendicazione 5).
La presente invenzione può essere usata per ottenere informazioni su recettori di segnalazione di componenti della parete di cellule batteriche (rivendicazione 6).
La presente invenzione può essere usata in un metodo per rivelare componenti di cellule batteriche, il quale metodo comprende le fasi di: (i) somministrare il materiale soggetto a a) un animale o cellula come definiti in qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 e b) ad un animale non umano o cellula di tipo selvaggio e (ii) valutare e confrontare la reattività nei confronti del materiale soggetto (rivendicazione 7).
La presente invenzione può essere usata per ottenere informazioni per lo sviluppo di farmaci per malattie causate da eccessiva produzione di componenti della parete di cellule batteriche (rivendicazione 8).
In relazione all'uso della presente invenzione, il componente della parete di cellule batteriche è una lipoproteina/lipopeptide (rivendicazione 9). La lipoproteina/lipopeptide può, per esempio, essere derivata da componenti cellulari di batteri che appartengono a Mycoplasma, Spirochaeta o Escherichia (rivendicazione 10).
In relazione all'uso della presente invenzione, il componente della parete di cellule batteriche è un peptidoglicano (rivendicazione 11), un'endotossina (rivendicazione 12), acido lipoteicoico (rivendicazione 13) o lisato di Mycobacterium tuberculosis (rivendicazione 14).
La presente invenzione può essere usata per stabilire un metodo di trattamento per lo shock da endotossina (rivendicazione 15).
La presente invenzione può essere usata per chiarire il meccanismo molecolare in un processo di infezione da batteri nei confronti dei quali componenti della parete cellulare l'animale è non reattivo (rivendicazione 16).
La presente invenzione può essere usata per sviluppare nuovi rimedi per infezione da batteri nei confronti dei quali componenti della parete cellulare l'animale è non reattivo (rivendicazione 17).
Breve Spiegazione dei Disegni
La Fig. 1 è un grafico che mostra mappe geniche di topi knockout MyD88 e di topi di tipo selvaggio.
La Fig. 2 è un grafico che mostra indici di sopravvivenza di topi knockout MyD88 e di topi di tipo selvaggio aventi un'iniezione di LPS derivato da Escherichia coli.
La Fig. 3 è un grafico che mostra i risultati della proliferazione di cellule T mediata da IL-1 in topi knockout MyD88 ed in topi di tipo selvaggio.
La Fig. 4 è un grafico che mostra i risultati dei livelli nel sangue di TNF-α e di IL-6, indotti da IL-1, in topi knockout MyD88 ed in topi di tipo selvaggio.
La Fig. 5 è un grafico che mostra i risultati dell'attivazione di cellule NK mediata da IL-18 in topi knockout MyD88 ed in topi di tipo selvaggio.
La Fig. 6 è un grafico che mostra i risultati della produzione di IFN-γ stimolato da IL-12 e IL-18 in topi knockout MyD88 ed in topi di tipo selvaggio.
La Fig. 7 è un grafico che mostra che la mutazione di MyD88 dominante negativo è implicata nell'attività di NF-κB e nell'attività di AP-1 indotte da IL-18.
La Fig. 8 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di Salmonella minnesota Re-595.
La Fig. 9 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di IL-4 ed interferone-γ.
La Fig. 10 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di Porphyromonas gingivalis.
La Fig. 11 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di Escherichia coli 055:B5 .
La Fig. 12 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti del peptidoglicano.
La Fig. 13 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti dell'acido lipoteicoico.
La Fig. 14 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di lisati cellulari interi di Mycobacterium tuberculosis.
La Fig. 15 è un grafico che mostra mappe geniche di topi knockout TLR2 e di topi di tipo selvaggio.
La Fig. 16 è un grafico che mostra indici di sopravvivenza di topi knockout TLR2 e di topi di tipo selvaggio aventi un'iniezione di LPS derivato da Escherichia coli.
La Fig. 17 è un grafico che mostra la quantità di produzione, indotta da lipide A o da LPS, di IL-6, TNF-α o NO2- in topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4.
La Fig. 18 è un grafico che mostra i risultati della reattività di cellule B spleniche di topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di LPS derivato da Salmonella minnesota Re-595.
La Fig. 19 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi peritoneali di topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4 nei confronti di frazioni della parete cellulare di batteri Gram-positivi.
La Fig. 20 è un grafico che mostra la quantità di produzione, indotta da PGN o da LTA, di IL-6, NO2- o TNF in topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4.
La Fig. 21 è un grafico che mostra i risultati di un saggio di chinasi stimolata da LPS o da PGN in vitro, analisi Western blot e saggio di variazione della mobilità elettroforetica in topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio e topi knockout TLR4.
La Fig. 22 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi peritoneali di topi CH3/HeJ nei confronti del lipopeptide MALP-2.
La Fig. 23 è un grafico che mostra i risultati della reattività di monociti umani nei confronti del lipopeptide MALP-2.
La Fig. 24 è un grafico che mostra i risultati della reattività di macrofagi peritoneali di topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio, topi knockout TLR4 e topi knockout MyD88 nei confronti del lipopeptide MALP-2.
La Fig. 25 è un grafico che mostra i risultati di un saggio di chinasi stimolata dal lipopeptide MALP-2 in vitro, analisi Western blot e saggio di variazione della mobilità elettroforetica in topi knockout TLR2, topi di tipo selvaggio, topi knockout TLR4 e topi knockout MyD88.
Modo migliore per eseguire l'invenzione
Esempi di componenti di cellule batteriche includono: una lipoproteina/lipopeptide, che è un componente cellulare di batteri che appartengono a Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia; peptidoglicano costituito combinando polisaccaridi che si ripetono di N-acetilglucosammina ed acido N-acetilmurammico, che è una struttura dello scheletro della parete di cellule batteriche, e catene peptidiche relativamente corte; lipopolisaccaride (LPS), che esiste principalmente come un componente della membrana esterna di batteri Gram-negativi ed è anche chiamato endotossina; acido lipoteicoico (LTA), che è un componente della parete cellulare di batteri Gram-positivi; lisato di Mycobacterium tuberculosis; ed una frazione della parete cellulare di batteri Gram-positivi. Inoltre, in relazione alla presente invenzione, vettori che trasportano i componenti di cellule batteriche menzionati sopra e la cellula batterica stessi, sono vantaggiosamente inclusi negli esempi dei componenti di cellule batteriche.
In relazione alla presente invenzione, “non reattività nei confronti di componenti di cellule batteriche” intende che gli animali non umani, o cellule, tessuto od organi derivati da questi, mostrano bassa reattività o quasi nessuna reattività agli stimoli dei componenti di cellule batteriche, ed “iporeattività” intende bassa reattività agli stimoli. Dunque, un modello animale non umano che è non reattivo nei confronti di componenti di cellule batteriche in relazione alla presente invenzione intende un animale non umano, come un topo, un ratto, un coniglio o similari, dove organismi viventi, o cellule, tessuto od organi che costituiscono organismi viventi mostrano bassa reattività o quasi nessuna reattività agli stimoli dei componenti di cellule batteriche. Esempi degli stimoli dei componenti di cellule batteriche includono uno stimolo in vivo, dove un componente di cellule batteriche è somministrato ad un organismo vivente ed uno stimolo in vitro, dove un componente di cellule batteriche è portato a contatto con cellule separate da un organismo vivente. Come esempio di un modello animale non umano che è non reattivo nei confronti di componenti di cellule batteriche, è esemplificato un animale non umano non reattivo nei confronti di componenti di cellule batteriche, come una lipoproteina/lipopeptide, peptidoglicano, una frazione della parete cellulare di batteri Gram-positivi, endotossina, acido lipoteicoico, lisato di Mycobacterium tuberculosis e similari, e, specificatamente, è esemplificato un animale non umano la cui funzione del gene MyD88 è carente sul suo cromosoma, per esempio un topo knockout MyD88 e similari.
In relazione alla presente invenzione, “carenza di funzione del gene MyD88 su un cromosoma” indica che una parte di o un intero gene MyD88 è carente su un cromosoma e la funzione per esprimere MyD88, che è espresso in tipi selvaggi, è persa. Esempi di un animale non umano la cui funzione del gene MyD88 è carente sul suo cromosoma includono un roditore come un ratto o similari, la cui funzione del gene MyD88 è carente, eccetto topi knockout MyD88.
L'espressione "un animale non umano di tipo selvaggio" in associazione alla presente invenzione indica un animale non umano della stessa specie dell'animale non umano la cui funzione del gene MyD88 è carente sul suo cromosoma. Nel caso di topi, ad esempio, indica topi di tipo non carente di MyD88 della stessa specie tra topi F2 generati al rapporto mendeliano atteso. Quando i topi di tipo carente e i topi di tipo selvaggio di questi topi F2, in particolare i cuccioli di tipo selvaggio, sono usati per esperimenti in modo simultaneo, diventa possibile condurre esperimenti comparativi precisi a livello individuale. Con un esempio di topi knockout che hanno carenza di MyD88, sarà ora spiegato un metodo di generazione dell'animale non umano la cui funzione di gene MyD88 sul suo cromosoma è carente.
Il gene MyD88 può essere clonato amplificando una libreria genomica murina mediante PCR od altri metodi con una sonda derivata da un clone di EST di topo o similari. Mediante tecnica di ricombinazione del DNA, una parte di o tutto questo gene clonato MyD88, per esempio, una parte di od un intera regione dell'esone contenente una regione citoplasmatica del gene MyD88 è sostituita con un segnale di poli A e un gene marcatore come un gene di resistenza alla neomicina o similari, un vettore di localizzazione viene costruito inducendo geni come gene del frammento della tossina difterica A (DT-A) o gene della timidina chinasi del virus herpes simplex (HSV-tk) o similari nel lato 5'-terminale, questo vettore di localizzazione costruito è linearizzato ed introdotto in cellule staminali embrionali (cellule ES) per metodo di elettroporazione o similari, quindi coltivato e successivamente cellule ES che realizzano ricombinazione omologa sono selezionate mediante G418, ganciclovir (GANC) od altri tali antibiotici. E' preferibile confermare se queste cellule ES selezionate siano i ricombinanti oggetto mediante analisi Southern blot o similari.
È possibile ottenere topi chimerici microiniettando le cellule ES ricombinate in blastocisti di topi, e rimettere le blastocisti in uteri di topi riceventi. Sotto un rapporto chimerico elevato, nasceranno molto di più topi chimerici di sesso maschile che di sesso femminile. In tal caso, topi ricombinanti eterologhi ( /-: F1) sono generati incrociando i topi chimerici con topi femmina di tipo selvaggio, e i topi ricombinanti omologhi [F2; topi di tipo selvaggio ( / ), topi knockout MyD88 (-/-)] possono essere ottenuti accoppiando i topi maschi ricombinanti eterologhi e i topi femmina. Tutti questi topi sono generati al rapporto mendeliano atteso. Come il metodo per confermare se sono nati topi knockout MyD88 della presente invenzione, sono ad esempio chiariti il metodo in cui RNA è isolato da macrofagi peritoneali di topi ottenuto dal succitato metodo, ed è esaminato mediante analisi Northern o similari, e il metodo in cui l'espressione di MyD88 nei topi è esaminata mediante analisi Western blot o similari.
E' possibile confermare che i topi knockout MyD88 generati sono non reattivi nei confronti di componenti della parete cellulare di batteri, per esempio mettendo in contatto una lipoproteina/lipopeptide, che è un componente cellulare di batteri che appartengono a Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia o similari, con macrofagi di topi knockout MyD88 o con monociti umani in vitro, e poi misurando la quantità di produzione di TNF-α o NO2- nelle cellule; iniettando LPS, che è un componente della parete cellulare di batteri Gram-negativi, in topi knockout MyD88 attraverso iniezione intravenosa o similari, e poi misurando la bioattività dell'endotossina, come febbre, shock, diminuzione di leucociti o di piastrine, necrosi emorragica di cellule di midollo osseo, ipoglicemia, induzione di IFN, attivazione di linfocita B (cellula della risposta immune derivata dal midollo) o similari; misurando l'induzione di IFN, la risposta proliferativa di cellule B spleniche, l'espressione di antigene MHC di classe II sulla superficie di cellule B spleniche, in macrofagi o cellule B spleniche di topi knockout MyD88, in presenza di LPS derivato da batteri, o peptidoglicano, che è un componente cellulare di batteri Gram-negativi, acido lipoteicoico, lisato di Mycobacterium tuberculosis o similari.
I topi knockout MyD88 usati nella presente invenzione sono non reattivi nei confronti di una lipoproteina/lipopeptide, che è un componente di cellule batteriche, e mostrano reattività più bassa nei confronti dell'endotossina rispetto a topi C3H/HeJ, che finora sono risultati noti come essere iporeattivi nei confronti dell'endotossina, e non è stato osservato nessun sintomo di shock. Inoltre, macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88 sono non reattivi non solo nei confronti dell'endotossina, ma anche nei confronti del peptidoglicano, il quale è un componente della parete cellulare di batteri Gram-positivi, dell'acido lipoteicoico, del lisato di Mycobacterium tuberculosis e similari, mentre sono reattivi nei confronti di IL-4 e IFN. Dunque, i topi knockout che sono non reattivi nei confronti di componenti di cellule batteriche possono essere usati come modello utile per chiarire i meccanismi di azione di una lipoproteina/lipopeptide, endotossina, peptidoglicano, acido lipoteicoico o similari, e per stabilire un metodo di trattamento per lo shock da endotossina.
La presente invenzione fornisce l'uso di una cellula di macrofago o di splenocita derivata da un animale non umano la cui funzione di MyD88 è carente sul suo cromosoma, come un modello di cellula non reattivo nei confronti di componenti della parete di cellule batteriche.
Come metodo per misurare e valutare l'attività di livello macrofagica, è esemplificato il metodo per misurare e valutare la quantità di produzione di citochina e/o ione nitroso nel macrofago, e come metodo per misurare e valutare il livello di attività splenocitica, è esemplificato un metodo per misurare e valutare la quantità di MHC classe II di espressione nello splenocita. Misurando e valutando il livello di attività macrofagica o il livello di attività splenocitica, è preferibile valutare i livelli rispetto al valore misurato di un animale non umano di tipo selvaggio, in particolare un animale non umano di tipo selvaggio cucciolo dell'animale non umano che è non reattivo verso componenti di cellule batteriche come controllo, in quanto non sarà causata alcuna dispersione da differenze individuali. Questo può essere applicato alla valutazione della bioattività di vari materiali soggetto e alla rivelazione di componenti di cellule batteriche e similari, in cui è usato l'animale non umano che è non reattivo verso i componenti di cellule batteriche.
La relazione tra IL-1 e la malattia nei topi del modello di malattia può essere esaminata valutando con precisione l'attività di IL-1 di un materiale soggetto con topi knockout MyD88. Diventa possibile ottenere informazioni utili per sviluppare medicinali che possano curare malattie come artrite reumatoide causata da sovraespressione di IL-1, una malattia del trapianto contro l'ospite, asma e similari, valutando con precisione l'attività di IL-1 di un materiale soggetto ed analizzando l'implicazione di IL-1 nei topi del modello di malattia. Esempi di attività di IL-1 come scopo di valutazione includono mitogeni, per esempio fitoemagglutinina (PHA), concanavalina A (Con A) e similari, attività di induzione della proliferazione di cellule T causata da co-stimolazione con IL-2 ad una bassa concentrazione, ed attività che induce la produzione di TNF-α, IL-1 e IL-6, lavorando su monociti e macrofagi.
Inoltre, valutando con precisione l'attività di IL-1 di un materiale soggetto con topi knockout MyD88, diventa possibile ottenere utili informazioni per sviluppare medicinali che possano curare malattie causate da sovraespressione di IL-18, come diabete di tipo I, una malattia del trapianto contro l'ospite e similari. Esempi dell'attività di IL-18 come scopo di valutazione includono attività che favorisce la produzione di IFN-γ, attività che aumenta l'attività di cellule NK, attività che induce la produzione di IFN-γ da cellule T in cooperazione con IL-12, ed azione che attiva IRAK o NF-κB.
La presente invenzione fornisce l'uso di un animale non umano la cui funzione di MYD88 è carente sul suo cromosoma, in un metodo per rivelare componenti di cellule batteriche, il quale metodo comprende le fasi di: (i) somministrare il materiale soggetto a a) un animale la cui funzione di MyD88 sia carente sul suo cromosoma, o cellula derivata da questo e b) ad un animale non umano o cellula di tipo selvaggio e (ii) valutare e confrontare la reattività nei confronti del materiale soggetto.
Con il metodo per rivelare i componenti di cellule batteriche, è possibile rivelare una quantità inconsistente di componenti di cellule batteriche contenuti in materiali soggetto nell'animale non umano che è non reattivo nei confronti di componenti di cellule batteriche dopo che il materiale soggetto è stato somministrato all'animale non umano. Gli esempi di tali componenti di cellule batteriche includono: una lipoproteina/lipopeptide derivata da un componente cellulare di batteri che appartengono a Mycoplasma, Spirochaeta, Escherichia e similari; endotossina derivata da Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Vibrio cholerae, Salmonella minnesota, Porphyromonas gingivalis e similari; peptidoglicano derivato da Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Nocardia coeliaca e similari; acido lipoteicoico derivato da Streptococcus pneumoniae e similari; e lisati cellulari interi di Mycobacterium tuberculosis.
La presente invenzione sarà spiegata più nello specifico attraverso gli esempi di seguito, ma l'ambito tecnologico della presente invenzione non è limitato a questi esempi.
Esempio 1 (Generazione di topi knockout MyD88)
Un gene MyD88 è stato sottoposto a screening da una libreria genomica murina 129/SvJ (Stratagene), subclonato in un vettore pBluescript (Stratagene) e caratterizzato per mappatura enzimatica di restrizione e sequenziamento del DNA. Un vettore di localizzazione è stato costruito sostituendo il frammento genomico di 1,0 kb dell'allele di tipo selvaggio con un gene di resistenza alla neomicina da pMC1-neo (Stratagene). Il frammento genomico sostituito conteneva due esoni codificanti per il dominio che assomiglia al dominio citoplasmatico del IL-1RAcP (proteina accessoria del recettore). Il gene di resistenza alla neomicina è stato fiancheggiato dal frammento genomico 5' di 1,1 kb e dal frammento 3' di 5,2 kb. Quindi, una cassetta di HSV-tk è stata introdotta nel terminale 3' del frammento genomico. Cellule ES E14.1 sono state trasfettate con il vettore di localizzazione linearizzato e selezionate con G418 e ganciclovir. 176 cloni doppiamente resistenti sono stati sottoposti a screening per ricombinazione omologa mediante PCR e 33 cloni sono stati confermati mediante analisi Southern blot usando la sonda indicata nella Fig. 1.
Tre cloni ES localizzati, indipendentemente identificati, sono stati microiniettati nelle blastocisti di topi C57BL/6. Topi chimerici così ottenuti sono stati accoppiati con topi femmine C57BL/6 per produrre topi eterozigoti. I topi eterozigoti sono stati incrociati per ottenere omozigoti, e carenti di MyD88 sono stati generati ai rapporti mendeliani attesi ( / : /-:-/- = 52:93:53) dall'incrocio. I topi knockout MyD88 della presente invenzione sono cresciuti sani e non hanno mostrato alcuna anomalia evidente fino alle 20 settimane di età. Un'analisi Northern blot è stata eseguita per confermare che l'inattivazione del gene MyD88 fosse causata da mutazione. L'mRNA di MyD88 non ha potuto essere rivelato nel fegato e nella milza dei topi carenti di MyD88. L'analisi citometrica a flusso di CD3, B220, CD4 e CD8 in timo, milza e linfonodo ha mostrato che la composizione dei linfociti non era alterata nei topi knockout MyD88 in confronto ai topi di tipo selvaggio.
Esempio 2 (Non reattività di topi knockout MyD88 nei confronti di Endotossina)
1 mg di LPS derivato da Escherichia coli (055:B5) è stato somministrato a 10 topi knockout MyD88 della presente invenzione, e la non reattività nei confronti dell'endotossina è stata esaminata attraverso il rapporto di sopravvivenza dei topi. 10 cuccioli di tipo selvaggio sono stati usati come controllo. I risultati sono mostrati in Fig. 2. E' confermato dalla Fig. 2 che, sebbene i topi di tipo selvaggio abbiano risposto a LPS e tutti siano morti entro 4 giorni dopo la somministrazione, nessuno dei topi knockout MyD88 è morto entro 4 giorni dopo la somministrazione di LPS, e che i topi sono non reattivi all'endotossina.
Esempio 3 (Funzioni deteriorate mediate da IL-1 in topi knockout MyD88)
1 × 105 timociti dei topi knockout MyD88 sono stati coltivati in piastre a 96 pozzetti per 72 ore con miscele contenenti 2 µg/ml di fitoemagglutinina (PHA), che è un co-stimolante di IL-1 per la proliferazione di cellule T, 2,5 µg/ml di concanavalina A (ConA), o 2 ng/ml di IL-2 rispettivamente, e 100 U/ml di IL-1β (Genzyme), e le cellule T sono state fatte proliferare. La proliferazione di cellule T è stata esaminata misurando la quantità di [3H] di [3H]-timidina assorbita nelle cellule. Come risultato, timociti di cuccioli di tipo selvaggio mostravano aumentata proliferazione quando coltivati con PHA, ConA o IL-2 in presenza di IL-β, comunque, timociti dei topi knockout MyD88 non mostrano quasi nessuna aumentata proliferazione (vedere Fig. 3). E' stato trovato che risultati similari potevano essere ottenuti anche quando erano usate cellule B spleniche, invece di timociti.
Inoltre, timociti di topi knockout MyD88 sono stati coltivati con 10 ng/ml di forbolo 12-miristato 13-acetato parametossiamfetamina (PMA) o 2,5 µg/ml di Con A in presenza di 20 ng/ml di IL-2 (Genzyme) nella stessa maniera menzionata sopra, ed è stato esaminato l'aumento della proliferazione. Non c'era differenza tra timociti di topi knockout MyD88 e di cuccioli di tipo selvaggio nella loro proliferazione riguardo alla reazione di IL-2 e PMA o Con A (vedere Fig. 3). Questi risultati indicano che il segnale di crescita mediato da IL-1 delle cellule T era deteriorato nei timociti di topi knockout MyD88.
Topi knockout MyD88 sono stati iniettati per via intravenosa con 1 pg di IL-β (Genzyme), e 2 ore più tardi sono stati presi fegato e sieri. L'RNA totale è stato estratto dal fegato usando reagente Trizol (GIBCO). Questo RNA (10 µg) è stato sottoposto ad elettroforesi e trasferito ad una membrana di nylon, poi è stata condotta un'analisi Northern blot con cDNA marcato con 32P per proteine di fase acuta, come siero amiloide A (SAA-I), siero amiloide P (SAP), e aptoglobina (HP). Nel confrontare l'aumento, indotto da IL-1, dell'espressione di mRNA in cuccioli di tipo selvaggio ed in topi knockout MyD88, l'aumento di induzione è stato osservato in topi di tipo selvaggio, ma non è stato osservato in topi knockout MyD88.
Poiché IL-1 induce la produzione di proteine di fase acuta, come fattore di necrosi tumorale (TNF-α) o IL-6, e citochine pro-infiammatorie, l'aumento delle concentrazioni di TNF-α ed IL-6 nel siero preso da topi knockout MyD88 della presente invenzione e da cuccioli di tipo selvaggio attraverso il metodo succitato è stato misurato mediante ELISA. Come risultato, le concentrazioni di TNF-α e di IL-6 aumentavano mediante IL-1β in topi di tipo selvaggio, mentre la concentrazione né di TNF-α, né di IL-6 aumentava mediante IL-1β in topi knockout MyD88 (vedere Fig. 4).
Quindi, le principali funzioni biologiche mediate da IL-1 sono state trovate essere severamente deteriorate in topi knockout MyD88.
Esempio 4 (Funzioni deteriorate mediate da IL-18 in topi knockout MyD88)
E' risultato ben noto che IL-18 aumenta l'attività litica delle cellule NK. Cellule B spleniche da topi knockout MyD88 e cuccioli di tipo selvaggio sono state coltivate in presenza od assenza di 20 ng/ml di IL-18 (Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) per 24 ore con cellule di localizzazione di cellule di linfoma di topo marcate con 51Cr (in seguito, "YAC-1"). 4 ore più tardi, 51Cr rilasciato nei sovranatanti è stato contato mediante un contatore gamma. Come risultato, quando cellule B spleniche sono state coltivate in presenza di IL-18 in vitro, l'attività litica nei confronti di cellule di localizzazione di YAC-1 era notevolmente aumentata in topi di tipo selvaggio, ma non era aumentata in topi knockout MyD88. Quando è stata usata IL-2 invece di IL-18, l'attività litica era anche aumentata in cellule B spleniche di topi knockout MyD88 (vedere Fig. 5).
Inoltre, cellule B spleniche di topi knockout MyD88 e dei loro cuccioli di tipo selvaggio sono state stimolate mediante 20 ng/ml di IL-18 e coltivate per 24 ore in vitro, poi la produzione di IFN-γ nei sovranatanti colturali è stata misurata mediante ELISA. Come risultato, la produzione di IFN-γ era indotta in topi di tipo selvaggio, comunque, la produzione di IFN-γ non era osservata in topi knockout MyD88 (vedere Fig. 5).
Cellule T spleniche di topi knockout MyD88 e dei loro cuccioli di tipo selvaggio, che sono state purificate al 95% od oltre, sono state coltivate su piastre rivestite di anticorpo anti-CD3 (20 µg/ml) (PharMingen) in presenza di 2 ng/ml di IL-12. 4 giorni dopo l'inizio della coltura, le cellule sono state raccolte e lavate con soluzione salina bilanciata di Hank. Le cellule lavate (2 × 105) sono state stimolate e coltivate di nuovo su piastre a 96 pozzetti rivestite di anticorpo anti-CD3 (20 µg/ml) per 24 ore con 20 ng/ml di IL-18 o 2 ng/ml di IL-12. La concentrazione di IFN-γ nei sovranatanti colturali è stata determinata mediante ELISA e confrontata. Il risultato indica che cellule T spleniche di topi knockout MyD88 non possono aumentare la produzione, reattiva nei confronti di IL-18, di IFN-γ (vedere Fig. 6).
Topi knockout MyD88 ed i loro cuccioli di tipo selvaggio sono stati iniettati per via intraperitoneale con 500 µg di Propionibacterium acnes (P. acnes) ucciso al calore. Sette giorni dopo l'iniezione, le cellule T sono state purificate dalla milza, poi coltivate e stimolate su piastre a 96 pozzetti rivestite di anticorpo anti-CD3 (20 µg/ml) per 24 ore in presenza od assenza di 20 ng/ml di IL-18. La concentrazione di IFN-γ nei sovranatanti colturali è stata determinata mediante ELISA. Topi knockout MyD88 ed i loro cuccioli di tipo selvaggio sono stati iniettati per via intravenosa con 2 mg di Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (Kyowa). 14 giorni dopo l'iniezione, le cellule T sono state purificate dalla milza, poi coltivate e stimolate per 24 ore, come descritto sopra, successivamente è stata misurata la concentrazione di IFN-γ. Come risultato, in entrambi i casi, un elevato livello di produzione di IFN-γ in risposta a IL-18 è stato osservato in topi di tipo selvaggio, ma il livello di produzione di IFN-γ non poteva essere aumentato in presenza di IL-18 in topi knockout MyD88 della presente invenzione (vedere Fig. 6).
Questi risultati dimostrano che topi knockout MyD88 sono difettosi nello sviluppo di cellule Th1 in vivo, come avviene con topi carenti di IL-18, e che le loro principali attività biologiche mediate da IL-18 sono state completamente abolite.
E' stato quindi esaminato se il mutante di MyD88 dominante negativo bloccasse anche l'attivazione di NF-κB indotta da IL-18. Cellule COS-7 sono state transitoriamente trasfettate con il vettore di espressione di MyD88 (aminoacido 152-296) assieme al gene reporter della luciferasi NF-κB-dipendente ed è stata misurata l'attività della luciferasi dopo il trattamento con IL-18. La co-espressione di MyD88 bloccava quasi completamente l'attivazione indotta da IL-18 (vedere Fig. 7).
Poiché IL-18 attiva l'informazione genica AP-1-dipendente, è stato investigato se anche MyD88 (aminoacido 152-296) agiva da mutante dominante negativo dell'attivazione di AP-1 indotta da IL-18. La stimolazione con IL-18 induceva un aumento da circa 3 a 4 volte nell'attività di AP-1, e questa attivazione era bloccata dalla co-espressione di MyD88 (aminoacido 152-296) (vedere Fig. 7). Questi risultati mostrano che MyD88 è implicato nell'attivazione sia di NF-κB sia di AP-1, indotta da IL-18.
Inoltre, è stato esaminato se l'attivazione di NF-κB indotta da IL-18 era osservata in cellule carenti di MyD88. Cellule T spleniche coltivate in presenza di IL-12 ed anticorpo anti-CD3 per 4 giorni sono state affamate per 3 ore e poi stimolate con IL-18. I nuclei estratti dalle cellule stimolate sono stati analizzati mediante un saggio di variazione della mobilità su gel, usando una sonda specifica contenente il sito di legame di NF-κB. L'attività di legame del DNA di NF-κB indotta da IL-18 è stata rivelata negli estratti nucleari da cellule di tipo selvaggio, ma non da cellule carenti di MyD88. D'altro canto, il trattamento di timociti di tipo selvaggio o carenti di MyD88 con TNF-α portava a quasi gli stessi livelli di attività di legame del DNA di NF-κB, dimostrando che la deteriorata attività di NF-κB, indotta da IL-18 in cellule carenti di MyD88, non era dovuta alla funzione anomala od al deterioramento della capacità di regolazione di NF-κB.
Oltre all'induzione dell'attivazione di NF-κB, IL-1 è anche nota per attivare la chinasi c-Jun N-terminale (JNK). Per verificare se IL-18 induce l'attivazione di JNK, è stato eseguito un saggio di chinasi in vitro usando GST-c-Jun-proteina di fusione come sostituto. Il trattamento con IL-18 induceva l'attivazione di JNK in cellule che sviluppavano Th1 di topi di tipo selvaggio. Comunque, l'attivazione di JNK indotta da IL-18 non era osservata in cellule carenti di MyD88. Per contro, la normale attivazione di JNK era osservata in cellule carenti di MyD88 trattate con TNF-α. L'attivazione di NF-κB e di JNK indotta da IL-18 era deteriorata in topi carenti di MyD88. Questi risultati dimostrano che MyD88 è essenziale per l'attivazione, indotta da IL-18, sia di NF-κB, sia di JNK.
Esempio 5 (Non reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi knockout MyD88 nei confronti di componenti della parete di cellule batteriche)
5-1 (Generazione di topi carenti di TLR4)
E' stato recentemente riportato che topi C3H/HeJ sono iporeattivi nei confronti di LPS a causa di una mutazione puntiforme missenso nel gene TLR4 del recettore Toll-simile (Science 282, 2085-8, 1998, J. Exp. Med. 189, 615-625, 1999, J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999), e gli inventori hanno dimostrato che macrofagi e cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 sono iporeattivi nei confronti di LPS, e che il gene TLR4 è essenziale per la segnalazione di LPS (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). Allo scopo di confrontare la reattività di macrofagi e cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 e carenti di MyD88 nei confronti di componenti della parete di cellule batteriche, topi carenti di TLR4 (F2 incrociato da 129/01aXC57BL/6) sono stati generati mediante localizzazione del gene, come descritto precedentemente (J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999). Gruppi della stessa età di topi di tipo selvaggio, carenti di TLR4 e carenti di MyD88 sono stati usati per i seguenti esempi.
5-2 (Preparazione di componenti della parete di cellule batteriche)
LPS di Escherichia coli Serotipo 055:B5 (Sigma), Klebsiella pneumoniae (Sigma), Pseudomonas aeruginosa Serotipo 10 (Sigma), Salmonella typhimurium (Sigma), Serratia marcescens (Sigma), Shigella flexneri Serotipo 1A (Sigma) e Vibrio cholerae Serotipo Inaba 569B (Sigma) e similari sono stati acquistati. Sono stati preparati mediante estrazione con fenolo e purificati per gel filtrazione. E' stato anche acquistato LPS da Salmonella minnesota Re-595, preparato mediante procedura di estrazione con fenolo-cloroformio-etere di petrolio (Sigma). LPS e Lipide A di Porphyromonas gingivalis 381 sono stati preparati con il metodo come descritto precedentemente (FEBS Lett. 332, 1994, 197-201). Lisati cellulari interi di Mycobacterium tuberculosis sono stati preparati con il seguente processo: ceppo Aoyama B di Mycobacterium tuberculosis (NIHJ 1635) è stato coltivato in brodo di Dubos (DIFCO) per 1 mese; le cellule sono state raccolte e risospese con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS); le cellule sono state sonicate.
5-3 (Preparazione di macrofagi peritoneali)
2 ml di tioglicollato al 4% sono stati iniettati per via intraperitoneale nei topi generati di tipo selvaggio, carenti di TLR4 e carenti di MyD88, rispettivamente. Tre giorni più tardi, le cellule dell'essudato peritoneale sono state isolate dalla cavità peritoneale e lavate con soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) raffreddata con ghiaccio, poi sono state ottenute cellule peritoneali. Le cellule sono state fatte galleggiare in mezzo RPMI1640, poi messe separatamente in piastre di plastica e coltivate per 2 ore a 37°C e lavate con soluzione salina bilanciata di Hank per rimuovere cellule non aderenti. Le cellule aderenti sono state usate come macrofagi peritoneali negli esperimenti sotto.
5-4 (Non reattività nei confronti di LPS di Salmonella minnesota Re-595)
La reattività di ciascun macrofago peritoneale dei topi di tipo selvaggio (tipo selvaggio), carenti di TLR4 (TLR4-/-), carenti di MyD88 (MyD88-/-) e similari nei confronti di LPS è stata esaminata con LPS di Salmonella minnesota Re-595. Macrofagi peritoneali da ciascun topo sono stati coltivati per 24 ore in presenza di varie concentrazioni (0, 0,01, 0,1, 1, 10 o 100 µg/ml) di LPS e stimolate, poi la concentrazione del fattore di necrosi tumorale (TNF-α) rilasciato da macrofagi reattivi a LPS è stata misurata mediante ELISA (vedere Fig. 8A). Da questi risultati, è stato trovato che la produzione di TNF-α aumenta in risposta a LPS in una maniera dose-dipendente in macrofagi di topi di tipo selvaggio, per contro, nessuna produzione di TNF-α è osservata in topi carenti di TLR4 o carenti di MyD88, anche quando ricevono stimoli di LPS ad una concentrazione di 100 µg/ml, e che questi topi sono non reattivi nei confronti di LPS.
Inoltre, è stata esaminata la reattività di cellule B spleniche nei confronti di LPS di Salmonella minnesota Re-595. Cellule B spleniche (1 x 105) di ciascuno dei topi di tipo selvaggio, carenti di TLR4 e carenti di MyD88 sono state isolate, coltivate in piastre a 96 pozzetti e stimolate mediante varie concentrazioni (0, 0,01, 0,1, 1, 10 o 100 µg/ml) di LPS. 1 µCi di [3H]-timidina (DuPont) è stato aggiunto 40 ore dopo l'inizio della coltura, poi le cellule sono state coltivate per altre 8 ore, e l'assorbimento di [3H] è stato misurato mediante un contatore di scintillazione β (Packard) (vedere Fig. 8B). Come risultato, la risposta proliferativa indotta da LPS è stata favorita in risposta a LPS in una maniera dose-dipendente in cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio, per contro, nessuna risposta proliferativa indotta da LPS è stata osservata in cellule B spleniche sia di topi carenti di TLR4, sia di topi carenti di MyD88.
L'espressione del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II (molecola I-Ab) sulla superficie di cellule B spleniche in risposta a LPS di Re-595 è stata esaminata mediante citometria a flusso. Cellule B spleniche (1 × 106) da ciascuno dei topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4 sono state coltivate per 48 ore in presenza di varie concentrazioni (0, 0,01, 0,1, 1, 10 o 100 µg/ml) di LPS. Dopo la coltura, le cellule sono state raccolte e poi colorate combinando la molecola I-Ab sulla superficie delle cellule e l'anticorpo marcato con FITC, che è costruito combinando anticorpo anti-B220 coniugato con ficoeritrina (PE; PharMingen) o anticorpo I-Ab anti-topo biotinilato (PharMingen) e streptavidina coniugata con fluoresceina isocianato (FITC; PharMingen). Le cellule colorate sono state analizzate su separatore cellulare attivato da fluorescenza Calibur (FACS Calibur), usando il software CELLQuest (Becton Dickinson). Come risultato, LPS di Re-595 causava un aumento nell'espressione della molecola I-Ab sulla superficie di cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio. Per contro, LPS di Re-595 non aumentava l'espressione della molecola I-Ab in cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 o carenti di MyD88, anche quando stimolate con elevata concentrazione di LPS (100 µg/ml) (vedere Fig. 8C). I risultati menzionati sopra indicano che sia topi carenti di TLR4, sia topi carenti di MyD88 sono non reattivi nei confronti di LPS di Salmonella minnesota Re-595.
5-5 (Reattività di topi carenti di TLR4 e carenti di MyD88 nei confronti di IL-4 e IFN-γ)
Allo scopo di esaminare se cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 e carenti di MyD88 siano non reattive a tutti gli stimoli, è stata investigata la reattività di cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 e carenti di MyD88 ad altri stimoli. L'investigazione dimostra che non c'era deterioramento riguardo alla loro reattività agli stimoli come descritto sotto, e che questi topi erano particolarmente difettosi nella loro risposta a LPS.
Cellule B spleniche (1 × 105) da ciascuno dei topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4 sono state isolate, coltivate per 40 ore in presenza sia di IL-4 (Genzyme), sia di anticorpo anti-IgM, od in presenza di anticorpo anti-CD40, poi è stata aggiunta [3H]-timidina (DuPont) e le cellule sono state coltivate per altre 8 ore, e l'assorbimento di [3H] è stato misurato mediante un contatore di scintillazione β (vedere Fig. 9A). Come risultato, cellule B spleniche sia di topi carenti di TLR4, sia di topi carenti di MyD88 mostravano la stessa reazione di cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio riguardo alla risposta a IL-4 e alla miscela di anticorpo anti-IgM, o all'anticorpo anti-CD40.
Cellule B spleniche (1 × 106) da ciascuno dei topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4 sono state quindi coltivate per 48 ore in presenza od assenza di 100 U/ml di IL-4, e poi stimolate. Successivamente, le cellule sono state colorate combinando la molecola I-Ab sulla superficie delle cellule B spleniche e l'anticorpo anti-B220 coniugato con PE o l'anticorpo I-Ab anti-topo coniugato con FITC. La proliferazione cellulare è stata misurata su separatore cellulare attivato da fluorescenza Calibur, usando il software CELLQuest (vedere Fig. 9B). Come risultato, cellule B spleniche sia di topi carenti di TLR4, sia di topi carenti di MyD88 mostravano la stessa reazione di quelle di topi di tipo selvaggio anche riguardo alla risposta a IL-4 .
Ciascuno dei topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4 è stato iniettato per via intraperitoneale con 5000 U di IFN-γ (Genzyme) o PBS. Tre giorni dopo l'iniezione, i macrofagi peritoneali sono stati raccolti e colorati combinando la molecola I-Ab sulla superficie delle membrane dei macrofagi e l'anticorpo I-Ab anti-topo coniugato con FITC, poi analizzati mediante separatore cellulare attivato da fluorescenza Calibur, usando il software CELLQuest (vedere Fig. 9C). Il risultato indicava che l'espressione della molecola I-Ab nei macrofagi peritoneali, in altre parole, il livello di blocco della proliferazione cellulare indotta da IFN, era comparativa tra topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4.
5-6 (Analisi della fagocitosi)
Macrofagi di topi di tipo selvaggio, carenti di MyD88 e carenti di TLR4 addizionati con lo 0,025% di sfere di lattice fluorescenti (0,75 µm) (Polyscience) sono stati coltivati per 2 ore a 37°C in un incubatore a CO2. Poi i materiali colturali sono stati energicamente lavati tre volte con PBS per rimuovere le sfere non fagocitate ed incubati con PBS contenente il 2,5% di formaldeide per 20 minuti, e fissati con formaldeide. La visualizzazione di queste cellule fissate con microscopio Axiophoto (Carl Zeiss, Inc.) mostrava che macrofagi peritoneali sia di topi carenti di TLR4, sia di topi carenti di MyD88 fagocitavano le particelle di lattice, e quindi che la capacità fagocitaria dei macrofagi di topi carenti di TLR4 e carenti di MyD88 non era deteriorata da questi altri stimoli.
5-7 (Reattività nei confronti di LPS di Porphyromonas gingivalis)
Poiché LPS di Porphyromonas gingivalis mostra qualche reazione nella sua capacità di attivare cellule di topi C3H/HeJ iporeattivi nei confronti di LPS (J. Immunol. 158, 1997, 4430-6), la reattività di ciascun topo nei confronti di LPS di Porphyromonas gingivalis è stata esaminata come nel caso con Salmonella minnesota Re-595. In macrofagi di topi di tipo selvaggio, TNF-α è stato indotto in risposta a LPS di Porphyromonas gingivalis in una maniera dose-dipendente. Comunque, macrofagi di topi carenti di TLR4 erano iporeattivi come quelli di topi C3H/HeJ, e mostravano solo la producibilità di TNF-α, che era circa un terzo di quella dei macrofagi di topi di tipo selvaggio. Per contro, macrofagi di topi carenti di MyD88 non producevano alcun TNF-α rivelabile, anche quando stimolati con elevata concentrazione di LPS (vedere Fig. 10A).
Cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 esibivano risposta proliferativa di basso livello nei confronti di LPS di Porphyromonas gingivalis 381, ed aumentavano l'espressione della molecola I-Ab di cellule B spleniche, comunque, cellule B spleniche di topi carenti di MyD88 non esibivano risposta proliferativa e l'espressione della molecola I-Ab non poteva essere confermata (vedere Fig. 10B e C). Inoltre, gli stessi risultati sono stati ottenuti con lipide A di Porphyromonas gingivalis 381. Questo indica che topi carenti di TLR4 sono iporeattivi e topi carenti di MyD88 sono non reattivi nei confronti di LPS di Porphyromonas gingivalis. Inoltre, è stato trovato che MyD88 è essenziale per la segnalazione indotta da LPS di Porphyromonas gingivalis, mentre TLR4 mostra un contributo parziale.
5-8 (Reattività nei confronti di LPS di Escherichia coli 055:B5)
La reattività nei confronti di LPS di Escherichia coli 055:B5 è stata esaminata come nel caso con Salmonella minnesota Re-595. La reattività nei confronti di LPS di Escherichia coli (055:B5) era deteriorata nei macrofagi peritoneali sia di topi carenti di TLR4, sia di topi carenti di MyD88, rispetto a quelli dei topi di tipo selvaggio (Fig. 11A). Comunque, quando stimolati con elevata concentrazione di LPS, macrofagi di topi carenti di TLR4 producevano una piccola quantità di TNF-α. Per contro, macrofagi di topi carenti di MyD88 non producevano TNF-α, anche quando stimolati con elevata concentrazione di LPS.
Tendenze similari sono state osservate in risposte proliferative nelle cellule B spleniche B di questi topi (vedere Fig. 11B). Inoltre, quando stimolate con LPS ad una concentrazione di più di 10 µg/ml, cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 mostravano un certo livello di espressione della molecola I-Ab, similare al livello mostrato da cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio. Per contro, cellule B spleniche di topi carenti di MyD88 non mostravano espressione della molecola I-Ab, anche quando stimolate con LPS ad una concentrazione di 100 µg/ml (vedere Fig. 11C). Come nel caso di stimoli con LPS di Porphyromonas gingivalis, questi risultati indicano che topi carenti di TLR4 sono iporeattivi e topi carenti di MyD88 sono non reattivi nei confronti di LPS di Escherichia coli (055:B5).
5-9 (Reattività nei confronti del peptidoglicano)
E' stato riportato che il Peptidoglicano (PGN), il quale è un principale componente della parete cellulare di batteri Gram-positivi, attiva i macrofagi (J. Immunol. 155, 1995, 2620-30, Infect. Immun. 62, 1994, 2715-21). Dunque, la reattività nei confronti di PGN di Staphylococcus aureus (Fluka) è stata esaminata come nel caso con Salmonella minnesota Re-595. Quando stimolati con PGN, macrofagi peritoneali di topi carenti di TLR4 producevano TNF-α in una maniera dose-dipendente in quasi la stessa misura di macrofagi di topi di tipo selvaggio. Per contro, macrofagi di topi carenti di MyD88 non producevano TNF-α anche quando stimolati con elevata concentrazione di PGN (vedere Fig. 12A).
Quando stimolate con PGN di Staphylococcus aureus, cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio mostravano risposte proliferative, e la risposta proliferativa era severamente deteriorata in macrofagi peritoneali di topi carenti di MyD88 rispetto a quelli di topi di tipo selvaggio, ma in topi carenti di TLR4, la risposta proliferativa non era severamente deteriorata come in topi carenti di MyD88 (vedere Fig. 12B). Inoltre, quando stimolate con PGN ad una concentrazione di più di 10 µg/ml, cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 e di tipo selvaggio mostravano aumento dell'espressione della molecola I-Ab. Per contro, cellule B spleniche di topi carenti di MyD88 non mostravano aumento dell'espressione della molecola I-Ab, anche quando stimolate con PGN ad una concentrazione di 100 µg/ml (vedere Fig. 12C). Quindi, topi carenti di TLR4 mostravano quasi la stessa risposta a PGN di Staphylococcus aureus dei topi di tipo selvaggio, mentre topi carenti di MyD88 non mostravano reattività.
5-10 (Reattività nei confronti dell'acido lipoteicoico)
Poiché l'acido lipoteicoico (LTA) è un componente della parete cellulare di batteri Gram-positivi ed induce attivazione di monociti e macrofagi (Infect. Immun. 62, 1994, 2715-21), la reattività nei confronti di LTA di Streptococcus pneumoniae è stata esaminata come nel caso con Salmonella minnesota Re-595. Macrofagi peritoneali di topi di tipo selvaggio aumentavano la produzione di TNF-α in risposta a LTA in una maniera dose-dipendente. Per contro, macrofagi di topi carenti di MyD88 non producevano TNF-α, anche quando stimolati con elevata concentrazione di LTA. In confronto a macrofagi peritoneali di topi di tipo selvaggio, la produzione di TNF-α era anche deteriorata in quelli di topi carenti di TLR4, comunque, TNF-α era indotto quando stimolati con 100 µg/ml di LTA (vedere Fig. 13A) .
Sono state quindi analizzate risposte proliferative ed aumento dell'espressione della molecola I-Ab in cellule B spleniche di questi topi in risposta alla stimolazione da LTA di Streptococcus pneumoniae (vedere Fig. 13B). I risultati indicavano che cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio aumentavano la loro risposta a LTA in una maniera dose-dipendente, mentre cellule B spleniche di topi carenti di MyD88 esibivano una risposta proliferativa a LTA severamente difettosa. Sebbene anche cellule B spleniche di topi carenti di TLR4 esibissero una risposta proliferativa deteriorata, esse esibivano risposta proliferativa quando stimolate con elevata concentrazione di LTA. Inoltre, in cellule B spleniche di topi di tipo selvaggio e carenti di TLR4, l'aumento dell'espressione della molecola I-Ab era anche osservato sulla superficie cellulare, mentre nessun aumento era osservato in quelle di topi carenti di MyD88 (vedere Fig. 13C). Questo indica che topi carenti di MyD88 sono non reattivi alla stimolazione da LTA di Streptococcus pneumoniae.
5-11 (Reattività nei confronti di lisati cellulari interi di Mycobacterial tuberculosis)
Poiché i componenti della parete cellulare di Mycobacterial tuberculosis, in particolare lipoarabinomannano, sono noti indurre l'attivazione di cellule mieloidi (J. Immunol. 149, 1992, 541-7, J. Clin. Invest. 91, 1993, 2076-83), la reattività nei confronti di lisati cellulari interi di Mycobacterial tuberculosis è stata esaminata come nel caso con Salmonella minnesota Re-595. Macrofagi di topi di tipo selvaggio producevano TNF-α in risposta ai lisati interi in una maniera dose-dipendente. Anche macrofagi di topi carenti di TLR4 esibivano produzione di TNF-
Da Inglese a Italiano: Optical Disc, Method And Apparatus For Managing A Defective Area On An Optical Disc (By LG Electronics KR) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese Optical Disc, Method And Apparatus For Managing A Defective Area On An Optical Disc
Description
Technical Field
The present invention relates to a method for managing a defective area on a high density optical disc, and more particularly to a write once optical disc, an apparatus and a method for managing a defective area on a high density optical disc such as a Blu-ray Disc Write Once (BD-WO).
Background Art
A new high density optical disc, on which high quality video, and audio data can be written, erased and rewritten for long periods of time, e.g., a Blu-ray Disc re-writable (BD-RE), is currently being developed.
As seen in FIG. 1, an optical disc device for writing and reproducing data to and from the BD-RE is provided with an optical pickup 11 for writing and reproducing a signal to and from an optical disc 10. A video disc recorder (VDR) system 12 for processing a signal from the optical pickup 11 as a reproduced signal, or demodulating and processing an external data stream into a writable signal suitable for writing is also shown. An encoder 13 for encoding, and providing an external analog signal to the VDR system 12 is also provided in the optical disc device.
As seen in FIG. 2, the BD-RE is divided into, and assigned a lead-in area (LIA), a data area, and a lead-out area (LOA). The data area is provided with a user data area, and an inner spare area (ISA) and an outer spare area (OSA) assigned to a fore end and a rear end of the user data area, respectively. The LIA is provided with a defect management area (DMA) having disc definition structure (DDS) information and a defect list (DFL) information for managing a defective area.
In the meantime, the VDR system 12 of the optical disc device writes the external data in clusters corresponding to an ECC Block unit having a predetermined recording size after encoding and demodulating the external signal into a signal suitable for writing. As shown in FIG. 2, if a defective area is found in the user data area when the data is being written in the user data area, the VDR system 12 carries out a series of replacement writing operations in which the clusters of data written on the defective area are written on one of the spare areas, e.g., on the inner spare area (ISA) in place of the defective area.
The VDR system 12 also writes and manages the defect list information for accessing the data written in the spare area during replacement writing operations. The defect list information has a predetermined recording size, e.g., a fixed recording size of four clusters, and includes a plurality of defect entries (Defect_Entry #1 ~ #n) each with written location information about the respective defective area, and written location information about the data written in the spare area during replacement.
Therefore, even if there is a defective area in the user data area of the BD-RE, the VDR system 12 can prevent a data writing error in advance by writing the clusters of data written on the defective area on the spare area in place of the detective area, and also reproducing the data from the spare area.
The Blu-ray Disc Write-Once (BD-WO) is another type of high density optical disc that is being developed where a high quality of data can be recorded and reproduced to and from the disc. As the name may suggest, data can be written only once on the BD-WO and is not re-writable on the BD-WO. However, the BD-WO can be read repeatedly As a result, the BD-WO is useful where the rewritability of data on a recording medium is not desired or essential.
Discussions on the standardization of high density optical discs, e.g., such as BD-WO, have recently been underway. In this regard, a disc structure, a method and an apparatus for managing defective areas of the BD-WO are needed, which accommodate and consider the unique characteristics and intended operations of the BD-WO. Such techniques will render the BD-WO commercially marketable and operationally feasible.
The features of the preambles of the independent claims are known from prior art documents EP 1 274 081 A2 and EP 0 350 920 A3.
In more detail, EP 1 274 081 A2 discloses an optical disk device having a means which reads data of an optical disk, the disk being provided in advance with an alternate area that serves as its substitute when there exists a defect in a data area, and being recorded in advance with list information consisting of a plurality of sets each of the set being formed of a position on the disk of the data area and an address of the alternate area, and buffers a data area being defective after correcting it, and a means which stores a new alternate list on which is recorded the correspondence relationship between the alternate area and its buffer destination. The means for buffering after correction is equipped with a normal data buffer means which refers to the new alternate list and buffers data in a normal data area without buffering data in a data are a which is defective, an alternate data buffer means which refers to the new alternate list and buffers data in the alternate area in a buffer area shown in the new alternate list, and a final data-buffer means which buffers an alternate data in a data area which is a defect of buffered data obtained by means of the normal data buffer means, by combining the buffered data obtained by means of the normal data buffer means and the buffered data obtained by means of the alternate data buffer means.
EP 0 350 920 A3 discloses a method of and an apparatus for managing defective sectors in an information recording medium such as a write-once optical disk and rewritable optical disk, in which many defective sectors may be generated and unevenly distributed. In the medium, alternative zones are formed which are composed of a prime area for recording user data the capacity of which is variable according to the volume capacity and partition capacity and the occurrence rate of defective sectors; a primary spare area for recording alternative sectors; and a primary defect list area for recording a primary defect list. Many defective sectors are managed in the units of alternative zones. When defective sectors cannot be substituted in an alternative zone (e.g., when defective sectors are locally concentrated defective sectors are managed hierarchically using a secondary alternative area, thereby reducing the amount of information to be handled for the management of defective sectors. Therefore, the size of the apparatus can be reduced, and defective sectors can be rapidly searched.
Further, an information recording medium including a data area for recording user data and an address area for recording address data that indicates the position of a defect management area that manages a defect present in the data area is disclosed by US 2002/0136537 A1
Disclosure of Invention
The present invention achieves one of more of these and other advantages not realized by the related art.
An object of the present invention is to provide a method for managing a defective area on an optical recording medium in which defect list information, or temporary defect list information for managing a defective area of a high density optical disc, such as a BD-WO, is written and managed more effectively and efficiently. For example, the method of the present is directed at reducing unnecessary loss of data recording capacity due to the defect list information or the temporary defect information.
The above object is solved by the combination of features of the independent claims. Preferred embodiments are defined in the respective dependent claims.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by a method for managing an optical recording medium having at least one temporary defect management area, and at least one spare area in a data area, the method comprising replacing data written in a defective area by writing the data written in the defective area to the at least one spare area as replacement data if the defective area within the data area is detected; and writing defect management information in the at least one temporary defect management area for access to the data written in the spare area, wherein the defect management information for access to the data written in the spare area is identified by at least one navigation pointer.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by a method for managing an optical recording medium having at least one temporary defect management area, and at least one spare area in a data area, the method comprising replacing data written in a defective area of the data area in the at least one spare area in place of the defective area as replacement data if the defective area within the data area is detected; and producing defect list information and disc definition structure information in the at least one temporary defect management area for access to the data written in the spare area as replacement data, and managing the defect list information and the disc definition structure information, wherein the defect list information includes defect entries corresponding to the replacement data actually written, and the disc definition structure information includes writing location information of a next available sector of the spare area for replacement writing as at least one navigation pointer.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by a recording medium comprising at least one spare area within a data area; a temporary defect management area for managing a defective area within the data area; a portion of the at least one spare area capable of storing replacement data,
wherein data written in the defective area is replaced by writing the data written in the defective area to the portion of the at least one spare area as the replacement data; and defect management information in the at least one temporary defect management area for access to the data written in the portion of the at least one spare area, wherein the defect management information for access to the data written in the spare area is identified by at least one navigation pointer.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by a recording medium comprising at least one spare area in the data area; a temporary defect management area for managing a defective area within the data area; a portion of the at least one spare area capable of storing replacement data, wherein data written in the defective area is replaced by writing the data written in the defective area to the portion of the at least one spare area as the replacement data; and defect list information and disc definition structure information in the temporary defect management area for access to the data written in the portion of the at least one spare area, wherein the defect list information includes defect entries corresponding to the replacement data actually written, and the disc definition structure information includes writing location information of a next available sector of the at least one spare area for replacement writing as at least one navigation pointer.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by an apparatus for managing an optical recording medium having at least one temporary defect management area, and at least one spare area in a data area, the apparatus comprising a combination of components for replacing data written in a defective area by writing the data written in the defective area to the at least one spare area as replacement data if the defective area within the data area is detected; and for writing defect management information in the at least one temporary defect management area for access to the data written in the spare area, wherein the defect management information for access to the data written in the spare area is identified by at least one navigation pointer.
One or more of these and other aspects of the invention are accomplished by an apparatus for managing an optical recording medium having at least one temporary defect management area, and at least one spare area in a data area, the apparatus comprising a combination of components for replacing data written in a defective area of the data area in the at least one spare area in place of the defective area as replacement data if the defective area within the data area is detected; and for producing defect list information and disc definition structure information in the at least one temporary defect management area for access to the data written in the spare area as replacement data, and managing the defect list information and the disc definition structure information, wherein the defect list information includes defect entries corresponding to the replacement data actually written, and the disc definition structure information includes writing location information of a next available sector of the spare area for replacement writing as at least one navigation pointer.
Further scope of applicability of the present invention will become apparent from the detailed description given hereinafter. However, it should be understood that the detailed description and specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are given by way of illustration only, since various changes and modifications within the spirit and scope of the invention will become apparent to those skilled in the art from this detailed description.
Brief Description of the Drawings
Further objects and advantages of the invention can be more fully understood from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings, in which:
FIG. 1 is a schematic of an optical disc device of the related art;
FIG. 2 is a block diagram of a method of the related art for managing a defective area on a BD-RE;
FIG. 3 is a block diagram of an optical disc recording and reproducing device according to an embodiment of the present invention;
FIGS. 4A and 4B illustrate a structure of a single layer BD-WO and a dual layer BD-WO optical disc, respectively, according to an embodiment of the present invention;
FIG. 5 is a block diagram of a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a block diagram of a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 7 is a block diagram of a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 8 is a block diagram of temporary defect list information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 9 is a block diagram of temporary defect list information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 10 is a block diagram of temporary defect list information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 11 is a block diagram of temporary defect list information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 12 is a block diagram showing defect definition structure information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 13 is a block diagram showing defect definition structure information written and managed according to a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 14 is a block diagram showing defect definition structure information written and managed according to a method for managing a defective area on a single layer BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention;
FIG. 15 is a block diagram showing defect definition structure information written and managed according to a method for managing a defective area on a dual layer BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention; and
FIG. 16 is a block diagram showing temporary defect list information written and managed according to a method for managing a defective area on a single layer BD-WO and a dual layer BD-WO in accordance with another preferred embodiment of the present invention.
Best mode for Carrying Out the Invention
Reference will now be made in detail to the preferred embodiments of the present invention, examples of which are illustrated in the accompanying drawings. Preferred embodiments of the present invention will be described in greater detail hereinafter with reference to FIGs. 3-16, and more particularly with reference to the optical disc recording and reproducing device 20 shown in FIG. 3.
FIG. 3 is a block diagram of an optical disc recording and reproducing device 20 according to a preferred embodiment of the present invention. The optical disc recording and/or reproducing device 20 (hereinafter optical disc recording/reproducing device) includes an optical pickup 22 for writing and reading data to and from an optical recording medium 21, a servo unit 23 for controlling the pickup 22 to maintain a distance between an objective lens of the pickup 22 and the recording medium 21 and for tracking relevant tracks on the recording medium 21, a data processor 24 for processing and supplying input data to the pickup 22 for writing, and for processing data read from the recording medium 21, an interface 25 for exchanging data and/or commands with any external host 30, a memory or storage 27 for storing information and data therein including defect management data associated with the recording medium 21, and a microprocessor or controller 26 for controlling the operations and elements of the recording/reproducing device 20.
Data to be written or read to or from the recording medium 21 may also be stored in the memory 27. All the components of the recording/reproducing device 20 are operatively coupled. In the exemplary embodiment shown, then recording medium 21 is a recording medium of write-once type, e.g., such as a BD-WO.
FIGS. 4A and 4B illustrate a structure of a single layer BD-WO and a dual layer BD-WO optical disc, respectively, according to an embodiment of the present invention. As shown in FIGS. 4A and 4B, the BD-WO can have one or two recording layers. In FIG. 4A, a BD-WO having only a single recording layer (Layer 0) includes a single recording layer composed of a lead-in area (LIA), a data area, and a lead-out area (LOA), and is referred to herein as a single layer disc. In FIG. 4B, a dual layer BD-WO includes two recording layers (Layers 0 and 1) and is referred to hereinafter as a dual layer disc. The first recording layer (Layer 0) includes a LIA, a data area, and an outer zone. The second recording layer (Layer 1) includes a LOA, a data area and an outer zone, and is referred to herein as a dual layer disc. Generally, a data writing occurs in the direction shown with the dotted arrow in the dual layer disc. The single layer disc can have a capacity of 23.3, 25.0 or 27.0 Gbytes, whereas the dual layer disc can have a capacity of 46.6, 50.0, or 54.0 Gbytes.
It should be noted that all the different embodiments of the present invention, e.g., various methods discussed hereinafter, are applicable to any type of an optical disc, such as a single layer BD-WO, a dual layer BD-WO or a BD-RE. Further, although the use of the-recording/reproducing device 20 of FIG. 3 is discussed below in conjunction with the methods of the invention, the invention is not limited to such and encompasses other recording/reproducing devices as long as they are configured to implement the present methods. For instance, the device shown in FIG. 1 may be used to implement the present methods as needed.
FIG. 5 is a block diagram of a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with an embodiment of the present invention. In this method, a defective area on a BD-WO is managed in a manner similar to the methods utilized for BD-RE, in which a new Temporary DFL (TDFL) having a fixed recording size of four clusters is defined for application to the BD-WO. In the exemplary method for managing a defective area shown in FIG. 5, first to third defect entries D_Ent #1 ∼ #3 produced during a process of replacement writing in the middle of a first data writing operation are written and managed as first temporary defect list (1st_TDFL) information of four clusters.
Next, a fourth entry D_Ent #4 produced during a process of replacement writing in the middle of a second data writing operation is added, so as to write and manage first to fourth defect entries D_Ent #1 ∼ #4 as second temporary defect list (2nd_TDFL) information of four clusters. In addition, a fifth entry D_Ent #5 produced during a process of replacement writing in the middle of a third data writing operation is added, so as to write and manage first to fifth defect entries D_Ent #1 ∼ #5 as third temporary defect list (3rd_TDFL) information of four clusters.
However, if the foregoing operations are carried out repeatedly, there may be a problem in that a data recording capacity of the BD-WO is wasted or otherwise used inefficiently since the TDFL information with a four cluster fixed recording size is written and rewritten many times.
That is, in a case of the BD-RE, use of the defect list information with a four cluster fixed recording size does not matter because prior defect list information can be renewed as the BD-RE is re-writable. However, in a case of the BD-WO, a data recording capacity of the BD-WO is wasted or used inefficiently because a prior defect list cannot be renewed in the non re-writable (write once) BD-WO and therefore requires writing new temporary defect list information. Therefore, the present inventors have determined that the prior defect list information cannot be efficiently renewed in this format in this type of system.
FIG. 6 is another block diagram of a method for managing a defective area on a BD-WO in accordance with a preferred embodiment of the present invention. As seen in FIG. 6, an exemplary BD-WO includes a lead-in area (LIA), a data area, and a lead-out area (LOA). The data area also includes a user data area with Physical Sector Numbers (PSN) and Logical Sector Numbers (LSN) provided together, and non-user data areas each only having physical sector numbers given thereto.
The non-user data area includes a spare area, e.g., an outer spare area (OSA) for writing data in place of a defective area, and a Temporary Defect List Area (TDFL Area) for writing management information on the defective area and the data written on the spare area. The OSA may be assigned to an ISA, or the ISA may be provided additionally in both locations. Similarly, the TDFL area may be assigned to a position adjacent to the OSA, or provided additionally in both locations.
The optical disc recording/reproducing device 20 of the optical disc device described with reference to FIG. 3 writes data continuously on a predetermined writing sector in the user data area when writing data. The predetermined data writing sector may be set as a Defect Verify Unit (DVU) of a recording size equivalent to one, or more than one, physical track or cluster for detecting the defective area during data writing.
After writing the data on the DVU, the optical disc recording/reproducing device 20 then repeats a series of defective area detecting operations in which the optical disc recording/reproducing device 20 reproduces the data written in the DVU, and verifies the data being written regularly. For example, after writing a first to a fifth cluster (clusters #1 ∼ #5) continuously as a first defect verify unit DVU #1 (S10), the optical disc recording/reproducing device 20 reproduces the data progressively written on the DVU #1, and detects any defective area.
For example, and as shown in FIG. 6, if a defective area is detected in the cluster #2 (S 11), the data in the cluster #2 stored in the memory 27 or other storage of the optical disc recording/reproducing device 20 is temporarily written on the OSA in place of the defective area (S 12).
In this instance, the cluster #2 may be written on the OSA starting from either the rear end or the fore end thereof. The optical disc recording/reproducing device 20 reproduces the data written on the DVU #1 starting from the cluster #3 after the writing operation. For example, and as shown in FIG. 6, if there is a defective area in the cluster #4 (S13), the data in the cluster #4. stored in the memory 27 or other storage of the optical disc recording/reproducing device 20 is temporarily written on the OSA in place of the defective area (S14).
Therefore, the DVU #1 will eventually have clusters #1, #3, and #5 written thereon regularly, and two defective areas. In contrast, the OSA has cluster #2 and #4 written thereon in place of the respective defective areas.
When a data recording having a temporary continuity (recording 1) ends while above defective area detection and replacement writing operation is continued in the DVU #1, DVU #2,... DVU #n, the optical disc recording/reproducing device 20 writes, in the TDFL area, management information as TDFL information for managing the defective areas and the data written in place of the defective areas.
In this instance, the management information can be written and managed as a TDFL in one example. As shown in FIG. 7, the TDFL may include a plurality of defect entries Defect_Entry #1 ...#m, each having a first physical sector number of the defective area (PSN of Defective), a first physical sector number of a data area where the replacement data for the defective area is written (PSN of Replacement), and a cross-reference to one another. The TDFL info includes a first physical sector of each TDFL, e.g., PSN of TDFL #1, a spare area size and any other management information as needed. Both the TDDS information and the TDFL information are transferred and written in a defect management area (DMA) of the BD-WO as defect management area information when the BD-WO is to be finalized or at some designated time.
The optical disc recording/reproducing device 20 writes in the TDFL area of the BD-WO and manages the temporary defect list information within a predetermined recording size of smaller than four clusters, e.g., such as one cluster recording size. For example, as shown in FIG. 8, the optical disc recording/reproducing device 20 writes in the TDFL area and manages the first to third defect entries D_Ent #1 ∼ #3 produced from a replacement writing process during a first data writing operation as first temporary defect list (1st_TDFL) information of one cluster. The first temporary defect list (1st_TDFL) information also includes writing location information (usable_Add) of the area of the spare area that is available for successive rewriting. For example, writing location information of the ISA having a possible, successive replacement writing location is included in the first temporary defect list (1st_TDFL). This writing location information serves as a navigation pointer directing the process of defect management to the appropriate locations of the data area.
The optical disc recording/reproducing device 20 then adds a fourth defect entry D_Ent #4 produced from a replacement writing process during a second data writing operation to form first to fourth entries D_Ent # 1 ∼ #4. The optical disc recording/reproducing device 20 writes in the TDFL area and manages the first to fourth entries D_Ent # 1 ∼ #4 as a second temporary defect list (2nd_TDFL) information of one cluster. The second temporary defect list (2nd_TDFL) information also includes new writing location information for the ISA successive replacement writing location if it is available.
The optical disc recording/reproducing device 20 then adds a new fifth defect entry D_Ent #5 produced from a replacement writing process during a third data writing operation to form first to fifth entries D_Ent #1 ∼ #5. The optical disc recording/reproducing device 20 then writes in the TDFL area and manages the first to fifth entries D_Ent #1 ∼ #5 as a third temporary defect list (3rd_TDFL) information of one cluster. The third temporary defect list (3rd_TDFL) information also includes new writing location information for the ISA successive replacement writing location if it is available.
Therefore, since the defect list information only includes defect entries for access to written replacement data actually written in the spare area, and writing location information for the spare area successive replacement writing locations if available, a recording size of the defect list information can be limited to one cluster. Accordingly, these navigation pointer(s) serve to reduce the required space for defect management information.
FIG. 9 shows an example of writing defect management information on a BD-WO when one of the spare areas, e.g., an ISA, is full with replacement data. Referring to FIG. 9, the optical disc recording/reproducing device 20 writes writing location information (usable_Add) for successive replacement writing therein (if possible) on the defect list. The optical disc recording/reproducing device 20 writes replacement data in an opposite direction of the data replacement writing direction in the OSA in which the data is written, e.g., starting from an outer side to an inner side.
Referring to FIG. 10, when the TDFL information to be newly written exceeds a recording size of one cluster due to an increase of the defect entries in the middle of production of the TDFL information of one cluster, the recording size of the TDFL newly produced is enlarged to two clusters from that time point forward according to a first embodiment of the present invention. For instance, when the third TDFL (TDFL #3) of one cluster size is full with the TDFL information written as discussed above, the allocated size of each subsequent TDFL is increased to, e.g., 2 clusters, to accommodate the increase in the TDFL information. In this manner, the allocated size of each TDFL may be increased further, as needed, e.g., from 2 to 4 clusters in recording size.
As seen in a second embodiment shown in FIG. 11, when the TDFL information to be newly written exceeds the recording size of one cluster due to an increase of the defect entries in the middle of writing the TDFL information in the first cluster, a record of the defect entries previously written is omitted from the new TDFL information, e.g., in the fourth TDFL (TDFL #4). Simultaneously, while the new TDFL information is written in one cluster, new defect entries and writing location information of the spare area successive replacement writing locations (if possible) are written thereon. In this way, the size of each TDFL can be maintained at or under one cluster, as allocated.
The TDFL information having the new defect entries written thereon, and the TDFL information written previously are grouped as a first group (Group #1) and a second group (Group #2). Identification information for identifying the first group and the second group, e.g., the index group (Index_Group) information, is included with the TDDS information which is written in a designated TDDS area of the BD-WO, e.g., the TDDS area in the LIA shown in FIG. 6.
Accordingly, the optical disc device can carry out regular defect area management and replacement writing operation with reference to the defect entries in the TDFL information and writing location information of the successive spare area locations for replacement writing (if available). In addition, the optical disc device can write and manage the TDFL information in the smallest possible recording size.
It should be noted that the TDFL information can be written in any particular area on the recording medium, and transferred to a permanent defect management area (DMA) on the BD-WO as DFL information. In addition, the TDDS information can also be assigned to any particular area on the recording medium, and transferred to the DMA as DDS information.
The present invention for writing and managing the minimum defect entries and the writing location information for successive replacement writing locations (if possible) is applicable not only to the BD-WO described hereinabove and shown in the accompanying figures, but also a variety of other recording media, e.g., such as BD-RW.
As seen in another embodiment of the present invention shown in FIG. 12, the minimum defect entries, and the identification information for indicating the end or termination of writing of the defect entries, e.g., such as defect list terminator (Defect List Terminator) information of 8 byte recording size, are written and managed in the first TDFL (TDFL #1). The writing location information of the successive replacement writing locations in the spare area (if available) is written and managed in the first TDDS (TDDS #1) information corresponding to the first TDFL information.
Further, for example, in the exemplary spare area of a BD-WO shown, the writing location information (1st_usable_spare_cluster) corresponding to a first sector of the first successive cluster available for replacement writing and the first physical sector number (the PSN of the first sector) for access to the first TDFL information (PSN of TDFL #1) are included in the first TDDS information.
Also, as shown in FIG. 13, when the new second TDFL information (TDFL #2) is renewed, new defect entries, and defect list terminator information indicating the termination of the writing of the defect list are written in the second TDFL information (TDFL #2).
Also, the writing location information (1st_usable_spare_cluster) corresponding to a first sector of the first cluster of the spare area available for successive replacement writing and the first physical sector number for access to the second TDFL information (PSN of TDFL #2) are included in the second TDDS corresponding to the second TDFL information.
Accordingly, the TDDS information (TDDS #k) includes a physical sector number for access to the newly written TDFL information (PSN of TDFL #k) and writing location information (1st_usable_spare_cluster) corresponding to a first sector of the first cluster of the spare area available for successive replacement writing.
Referring to FIG. 14, in the case of a BD-WO having a single layer and both the ISA and OSA, the TDDS (TDDS #k) includes writing location information (1st_usable_ISA0_cluster) corresponding to a first sector of the first cluster of the ISA available for successive replacement writing, and writing location information (1st_usable_OSA0_cluster) corresponding to a first sector of the first cluster of the OSA available for successive replacement writing.
As seen in FIG. 14, if the data replacement written in the OSA is written in a direction extending from an outer circumference toward an inner circumference of the optical disc, writing location information of a last sector of a cluster in front of the last data replacement written is written and managed as writing location information of the OSA available for successive replacement writing.
As seen in FIG. 15, in the case of a dual-layer BD-WO having inner spare areas (ISA0, and ISA1) and outer spare areas (OSAO, and OSA1) respectively assigned to the first layer (Layer 0) and a second layer (Layer 1), the TDDS information (TDDS #K) includes writing location information (1st_usable_ISA0_cluster, and 1st_usable_ISA1_cluster) corresponding to first sectors of the first clusters of the first and second inner spare areas available as successive replacement writing sectors, and writing location information (1st_usable_OSA0_cluster, and 1st_usable_OSA1_cluster) corresponding to first sectors of the first clusters of the first and second outer spare areas available as successive replacement writing sectors for defect management. These writing location information pieces can be written in the order shown or in different order.
As seen in FIG. 16, even in the case where the writing location information (usable_Add) of the spare area available for successive replacement writing is written and managed in the TDFL information as described with reference to FIGS. 7-11, if the BD-WO has a single layer with the ISA and the OSA assigned thereto (as shown in FIG. 16), the TDFL information includes the writing location information (usable_Add_ISA) identifying a first sector of a first cluster of the ISA available for successive replacement writing and the writing location information (usable_Add_OSA) identifying a first sector of a first cluster of the OSA available for successive replacement writing for defect management.
Moreover, in the case a BD-WO having a dual layer with inner spare areas (ISA0, and ISA1) and outer spare areas (OSA0, and OSA1) respectively assigned to the first layer (Layer 0) and the second layer (Layer 1), the TDFL information includes writing location information (usable_Add_ISA0, and usable_Add_ISA1) identifying first sectors of the first clusters of the first and second inner spare areas available as successive replacement writing sectors, and writing location information (usable_Add_OSA0, and usable_Add_OSA1) identifying first sectors of the first clusters of the first and second outer spare areas available for successive replacement writing for defect management for both inner and outer layers, respectively. These writing location information pieces can be written in the order shown or in other order.
In another embodiment, the writing location information identifying the available sector in one or more spare areas can be written in the TDFL and the TDDS if desired.
Accordingly, the optical disc recording and reproducing device 20 can carry out regular defect area management and replacement writing operations with reference to the defect entries in the TDFL information and writing location information in the TDDS information and/or the TDFL information, and can write and manage the TDFL information in the smallest possible recording size of the spare areas.
Industrial applicability
As has been described, the method for managing a defective area on a high density optical disc of writable once type permits more efficient writing and management of defect list information or temporary defect list information for managing the defective area in a minimum recording size, by writing a data in a defective area existing on a high density optical disc, such as a BD-WO, in a spare area in place of the defective area, producing defect list information for access to the data replacement written in the spare area and writing in a particular area for management, wherein defect entries actually corresponding to the replacement written data, and writing location information of the spare area successive replacement writing thereon are written and managed as defect list information for management, or the writing location information of which replacement writing is possible is written and managed in defect definition structure information.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the scope of the invention. Thus, it is intended that the present invention cover the modifications and variations of this invention provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.
Claims
1. A method for recording management information on an optical recording medium having a lead-in area, a data area and a lead-out area, the data area having a spare area being used for replacement writing,
characterized in that
the optical recording medium (21) comprises a temporary defect management area being used until the optical recording medium (21) is to be finalized and a permanent defect management area being used when the optical recording medium (21) is to be finalized; and
said method comprising steps of:
(a) replacing a defective area existing on the data area by writing replacement data for the defective area in the spare area;
(b) writing, into the temporary defect management area, temporary defect management information for access to the replacement data written in the spare area and at least one navigation pointer for access to the temporary defect management information written in the temporary defect management area; and
(c) writing, into the permanent defect management area, the temporary defect management information written in the temporary defect management area when the optical recording medium (21) is to be finalized.
2. The method according to claim 1, further comprising:
writing, into the temporary defect management area, location information indicating a next available location within the spare area for successive replacement writing.
3. The method according to claim 1 or 2, wherein the step (b) comprises writing, into the temporary defect management area, defect list information including a defect entry corresponding to the replacement data as the temporary defect management information.
4. The method according to claim 3, wherein the defect list information includes a defect list terminator for indicating an end of defect entries included in the defect list information, wherein in the step of (b) the defect list information including the defect list terminator is written in the temporary defect management area.
5. The method according to claim 2, wherein the location information is a first physical sector number of the next available location.
6. The method according to claim 5, wherein the optical recording medium (21) has a plurality of spare areas, wherein the location information is written per spare area.
7. The method according to one of claims 2, 5 and 6, further comprising:
writing new replacement data for a new defective area at the next available location indicated by the location information; and
writing new location information indicating a new next available location within the spare area into the temporary defect management area.
8. The method according to claim 7, further comprising writing new temporary defect management information including a defect entry corresponding to the new defective area.
9. A recording medium having a lead-in area, a data area and a lead-out area, the data area having a spare area being used for storing replacement data for a defective area existing on the data area,
characterized by
a temporary defect management area storing therein temporary defect management information for access to the replacement data written in the spare area and at least one navigation pointer for access to the temporary defect management information stored in the temporary defect management area until the recording medium (21) is to be finalized; and
a permanent defect management area storing therein defect management information, being written from the temporary defect management area into the permanent defect management area, when the recording medium (21) is to be finalized.
10. The recording medium according to claim 9, wherein the temporary defect management area further stores therein location information indicating a next available location within the spare area for successive replacement writing.
11. The recording medium according to claim 9 or 10, wherein defect list information including a defect entry corresponding to the defective area is stored as the temporary defect management information in the temporary defect management area.
12. The recording medium according to claim 9, wherein the location information is a first physical sector number of the next available location.
13. The recording medium according to claim 9, wherein the optical recording medium has a plurality of spare areas, wherein the temporary defect management area stores therein the location information per spare area.
14. The recording medium according to claim 9, wherein the recording medium (21) is a Blu-ray disc of writable once type (BD-WO).
15. The recording medium according to claim 11, wherein the defect list information has a recording size not larger than four clusters.
16. An apparatus for recording management information on an optical recording medium having a lead-in area, a data area and a lead-out area, the data area having a spare area being used for replacement writing,
characterized in that
the optical recording medium (21) comprises a temporary defect management area being used until the optical recording medium (21) is to be finalized and a permanent defect management area being used when the optical recording medium (21) is to be finalized; and
said apparatus comprises:
a pickup (22) configured to write or reproduce data into or from the optical recording medium (21); and
a controller (26) operatively coupled to the pickup (22) and configured to replace a defective area existing on the data area by controlling the pickup (22) to write replacement data for the defective area into the spare area; control the pickup (22) to write, into the temporary defect management area, temporary defect management information for access to the replacement data written in the spare area and at least one navigation pointer for access to the temporary defect management information written in the temporary defect management area; and control the pickup (22) to write, into the permanent defect management area, the temporary defect management information written in the temporary defect management area when the optical recording medium (21) is to be finalized.
17. The apparatus according to claim 16, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write location information indicating a next available location within the spare area for successive replacement writing.
18. The apparatus according to claim 16 or 17, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write, into the temporary defect management area, defect list information including a defect entry corresponding to the defective area as the temporary defect management information.
19. The apparatus according to claim 18, wherein the defect list information includes a defect list terminator for indicating an end of defect entries included in the defect list information, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write the defect list information including the defect list terminator into the temporary defect management area.
20. The apparatus according to claim 17, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write a first physical sector number of the next available location as the location information.
21. The apparatus according to claim 17, wherein the optical recording medium (21) has a plurality of spare areas, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write the location information per spare area.
22. The apparatus according to one of claims 17, 20 and 21, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write new replacement data for a new defective area at the next available location indicated by the locations information, and to control the pickup (22) to write new location information indicating a new next available location within the spare area into the temporary defect management area.
23. The apparatus according to claim 22, wherein the controller (26) is configured to control the pickup (22) to write new temporary defect management information including a defect entry corresponding to the new defective area into the temporary defect management area.
24. A method for reproducing management information from an optical recording medium having a lead-in area, a data area and a lead-out area, the data area having a spare area being used for replacement writing,
characterized in that
the optical recording medium (21) comprises a temporary defect management area being used until the optical recording medium (21) is to be finalized and a permanent defect management area being used when the optical recording medium (21) is to be finalized, and said method comprises steps of:
(a) reproducing at least one navigation pointer for access to temporary defect management information written in the temporary defect management area;
(b) reproducing the temporary defect management information for access to replacement data for a defective area existing on the data area based on the navigation pointer before the optical recording medium (21) is finalized; and
(c) reproducing the replacement data from the spare area in place of data written in the defective area based on the temporary defect management area.
25. The method according to claim 24, further comprising reproducing, from the temporary defect management area, location information indicating a next available location with the spare area for successive replacement writing.
26. The method according to claim 24 or 25, wherein the step of (b) comprises reproducing defect list information including a defect entry corresponding to the defective area as the temporary defect management information.
27. The method according to claim 26, comprising reproducing defect list terminator included in the defect list information, the defect list terminator indicating an end of defect entries included in the defect list information.
28. The method according to claim 25, wherein the optical recording medium (21) has plurality of spare areas, wherein the location information is
29. The method according to claim 24, further comprising:
reproducing defect management information written in the permanent defect management area after the recording medium (21) is finalized.
30. An apparatus for reproducing management information from an optical recording medium having a lead-in area, a data area and a lead-out area, the data area having a spare area being used for replacement writing,
characterized in that
the optical recording medium (21) comprises a temporary defect management area being used until the optical recording medium (21) is to be finalized and a permanent defect management area being used when the optical recording medium (21) is to be finalized, and said apparatus comprises:
a pickup (22) configured to reproduce data from the optical recording medium (21); and
a controller (26) operatively coupled to the pickup and configured to control the pickup to reproduce at least one navigation pointer for access to temporary defect management information written in the temporary defect management area; control the pickup to reproduce the temporary defect management information for access to replacement data for a defective area existing on the data area based on the navigation pointer before the optical recording medium (21) is finalized; and control the pickup to reproduce the replacement data from the spare area in place of data written in the defective area based on the temporary defect management area.
31. The apparatus according to claim 30, wherein the controller (26) is configured to control the pickup to reproduce, from the temporary defect management area, location information indicating a next available location with the spare area for successive replacement writing.
32. The apparatus according to claim 30 or 31, wherein the controller (26) is configured to control the pickup to reproduce defect list information including a defect entry corresponding to the defective area as the temporary defect management information.
33. The apparatus according to claim 32, wherein the controller (26) is configured to control the pickup to reproduce defect list terminator included in the defect list information, the defect list terminator indicating an end of defect entries included in the defect list information.
34. The apparatus according to claim 31, wherein the optical recording medium (21) has plurality of spare areas, wherein the controller (26) is configured to control the pickup to reproduce the location information per spare area.
35. The apparatus according to claim 30, wherein the controller (26) is configured to control the pickup to reproduce defect management information written in the temporary defect management area after the recording medium (21) is finalized.
Traduzione - Italiano Titolo: DISCO OTTICO, METODO ED APPARECCHIO PER LA GESTIONE DI UN'AREA DIFETTOSA SU UN DISCO OTTICO
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DESCRIZIONE
CAMPO TECNICO
La presente invenzione riguarda un metodo per la gestione di un'area difettosa su un disco ottico ad alta densità, e più in particolare un disco ottico scrivibile una sola volta, un apparecchio ed un metodo per la gestione di un'area difettosa su un disco ottico ad alta densità come ad esempio un disco Blu - ray Scrivibile Una Sola Volta (BD - WO).
TECNICA DI SFONDO
Un nuovo disco ottico ad alta densità, sul quale video di alta qualità, e dati audio possono essere scritti, cancellati e riscritti per lunghi periodi di tempo, ad esempio, un Disco Blu - ray riscrivibile (BD - RE), è attualmente in via di sviluppo.
Come si può vedere nella FIGURA 1, viene fornito un dispositivo a disco ottico per la scrittura e la duplicazione di dati da e verso il BD - RE con una testina ottica 11 per la scrittura e la duplicazione di un segnale da e verso un disco ottico 10. Viene altresì descritto un sistema di registrazione video su disco (VDR) 12 per l'elaborazione di un segnale dalla testina ottica 11 come un segnale duplicato, o per la demodulazione e l'elaborazione di un flusso di dati esterni in un segnale scrivibile adatto alla scrittura. Nel dispositivo a disco ottico, viene inoltre fornito un codificatore 13 per codificare e fornire un segnale analogico esterno al sistema VDR 12 .
Come si può vedere nella FIGURA 2, il BD - RE viene suddiviso e allocato mediante un'area di lead - in (LIA), un'area dati, ed un'area di lead - out (LOA). L'area dati è dotata di un'area dati utente, e di un'area interna riservata (ISA) e di un'area esterna riservata (OSA) allocate, rispettivamente, su una estremità anteriore e su una estremità posteriore dell'area dati utente. La LIA è dotata di un'area di gestione dei difetti (DMA) contenente le informazioni della struttura di definizione del disco (DDS) e le informazioni della lista dei difetti (DFL) per la gestione di un'area difettosa.
Allo stesso tempo, il sistema VDR 12 del dispositivo a disco ottico scrive i dati esterni in cluster corrispondenti ad un'unità di Algoritmo ECC aventi una dimensione di registrazione predefinita dopo la codifica e la demodulazione del segnale esterno in un segnale adatto alla scrittura. Come mostrato nella FIGURA 2, se viene individuata un'area difettosa nell'area dati utente nel momento in cui i dati stanno per essere scritti nell'area dati utente, il sistema VDR 12 esegue una serie di operazioni di scrittura di sostituzione in cui i cluster di dati scritti sull'area difettosa vengono scritti su una delle aree riservate, ad esempio, sull'area interna riservata (ISA) piuttosto che sull'area difettosa.
Il sistema VDR 12 inoltre scrive e gestisce le informazioni della lista dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata durante le operazioni di scrittura di sostituzione. Le informazioni della lista dei difetti hanno una dimensione di registrazione predefinita, ad esempio, una dimensione di registrazione fissa pari a quattro cluster, e comprendono una pluralità di entry dei difetti (Entry_Difetto # 1 - # n), ciascuna delle quali avente scritte le informazioni della locazione circa la relativa area difettosa, e ciascuna delle quali avente scritte le informazioni della locazione circa i dati scritti nell'area riservata durante l'operazione di sostituzione.
Pertanto, anche se vi è un'area difettosa nell'area dati utente del BD - RE, il sistema VDR 12 può impedire in anticipo che si verifichi un errore di scrittura dei dati mediante la scrittura dei cluster dei dati scritti sull'area difettosa sull'area riservata piuttosto che sull'area difettosa, e mediante la duplicazione dei dati dall'area riservata.
Il Disco Blu - ray Scrivibile Una Sola Volta (BD - WO) è un altro tipo di disco ottico ad alta densità che è in via di sviluppo e che consente di registrare e duplicare sul e dal disco dati di alta qualità. Come il nome stesso può suggerire, i dati possono essere scritti una sola volta sul BD - WO e non è possibile riscrivere sul BD - WO. Tuttavia, il BD - WO può essere letto più volte, per cui, il BD - WO è utile nelle applicazioni in cui la riscrivibilità dei dati su un supporto di registrazione non è desiderata o non è necessaria.
Discussioni sulla standardizzazione di dischi ottici ad alta densità, come ad esempio i BD - WO, sono state recentemente affrontate. A questo proposito, una struttura del disco, un metodo ed un apparecchio per la gestione delle aree difettose del BD - WO sono necessari, che favoriscano e prendano in considerazione le caratteristiche peculiari ed il funzionamento previsto del BD - WO. Tali tecniche renderanno il BD - WO appetibile dal punto di vista commerciale e realizzabile dal punto di vista operativo.
Le caratteristiche dei preamboli delle rivendicazioni indipendenti sono note da documenti della tecnica anteriore EP 1 274 081 A2 e EP 0 350 920 A3.
Più in dettaglio, EP 1 274 081 A2 divulga un dispositivo a disco ottico avente dei mezzi che leggono i dati di un disco ottico, il disco essendo dotato nella parte anteriore di un'area di scambio che serve come sua area sostitutiva nel momento in cui vi è un difetto in un'area dati, e che è registrata nella parte anteriore insieme alle informazioni della lista consistente di una pluralità di gruppi ciascuno dei quali essendo costituito da una posizione sul disco dell'area dati e da un indirizzo dell'area di scambio, e che eseguono la bufferizzazione di un'area dati difettosa dopo averla corretta, e di mezzi che memorizzano una nuova lista di scambio sulla quale viene registrata la relazione di corrispondenza tra l'area di scambio ed il suo buffer di destinazione. I mezzi che eseguono la bufferizzazione dopo la correzione sono dotati di normali mezzi buffer di dati che fanno riferimento alla nuova lista di scambio ed ai buffer di dati in una normale area dati senza eseguire la bufferizzazione dei dati in un'area dati che è difettosa, di mezzi buffer di dati di scambio che fanno riferimento alla nuova lista di scambio e che eseguono la bufferizzazione dei dati nell'area di scambio in un'area buffer indicata nella nuova lista di scambio, e mezzi buffer di dati definitivi che eseguono la bufferizzazione dei dati di scambio in un'area dati che è un difetto di dati bufferizzati ottenuti per mezzo dei normali mezzi buffer di dati, combinando i dati bufferizzati ottenuti per mezzo dei normali mezzi buffer dei dati ed i dati bufferizzati ottenuti per mezzo dei mezzi buffer dei dati di scambio.
EP 0 350 920 A3 divulga un metodo di ed un apparecchio per la gestione di settori difettosi in un supporto di registrazione di informazioni come ad esempio un disco ottico scrivibile una sola volta ed un disco ottico riscrivibile, in cui molti settori difettosi possono essere generati e distribuiti in maniera irregolare. Nel supporto, vengono costituite delle zone supplementari che sono composte da un'area principale per la registrazione dei dati utente la cui capacità è variabile in base alla capacità del volume e alla capacità della partizione ed al tasso di occorrenza dei settori difettosi; un'area riservata principale per la registrazione dei settori supplementari; ed un'area principale della lista dei difetti per la registrazione di una lista principale dei difetti. Molti settori difettosi vengono gestiti nelle unità delle zone supplementari. Quando i settori difettosi non possono essere sostituiti in una zona supplementare (ad esempio, quando i settori difettosi sono concentrati a livello locale i settori difettosi sono gestiti in maniera gerarchica utilizzando un'area supplementare secondaria, riducendo in questo modo la quantità di informazioni che devono essere trattate per la gestione dei settori difettosi). Pertanto, può essere ridotta la dimensione dell'apparecchio, ed i settori difettosi possono essere ricercati in maniera più rapida.
Inoltre, il documento US 2002 / 0136537 A1 divulga un supporto di registrazione di informazioni comprendente un'area dati per la registrazione dei dati utente ed un'area degli indirizzi per la registrazione dei dati degli indirizzi che indicano la posizione di un'area di gestione dei difetti che gestisce un difetto presente nell'area dati.
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE
La presente invenzione realizza uno o più di questi e di altri vantaggi non realizzati dalla relativa tecnica.
Un obiettivo della presente invenzione è quello di fornire un metodo per la gestione di un'area difettosa su un supporto ottico di registrazione in cui le informazioni della lista dei difetti, o le informazioni della lista temporanea dei difetti per la gestione di un'area difettosa di un disco ottico ad alta densità, come ad esempio un BD - WO, vengono scritte e gestite in maniera più efficace ed efficiente. Ad esempio, il metodo della presente invenzione è rivolto a ridurre l'inutile perdita di capacità di registrazione dei dati per via delle informazioni della lista dei difetti o per via delle informazioni temporanee dei difetti.
L'obiettivo di cui sopra viene raggiunto mediante la combinazione delle caratteristiche delle rivendicazioni indipendenti. Le forme preferite di realizzazione sono definite nelle relative rivendicazioni dipendenti.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati grazie ad un metodo per la gestione di un supporto ottico di registrazione avente almeno una area temporanea di gestione dei difetti, ed almeno una area riservata in un'area dati, il metodo comprendendo la sostituzione di dati scritti in un'area difettosa scrivendo i dati scritti nell'area difettosa sull'almeno una area riservata come dati di sostituzione qualora l'area difettosa venga individuata all'interno dell'area dati; e la scrittura delle informazioni di gestione dei difetti nell'almeno una area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata, in cui le informazioni di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata vengono identificate da almeno un puntatore di posizione.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati grazie ad un metodo per la gestione di un supporto ottico di registrazione avente almeno una area temporanea di gestione dei difetti, ed almeno una area riservata in un'area dati, il metodo comprendendo la sostituzione di dati scritti in un'area difettosa dell'area dati nell'almeno una area riservata piuttosto che nell'area difettosa come dati di sostituzione qualora viene individuata l'area difettosa all'interno dell'area dati; e la generazione delle informazioni della lista dei difetti e le informazioni della struttura di definizione del disco nell'almeno una area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata come dati di sostituzione; e la gestione delle informazioni della lista dei difetti e delle informazioni della struttura di definizione del disco, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendono le entry dei difetti corrispondenti ai dati di sostituzione effettivamente scritti, e le informazioni della struttura di definizione del disco comprendono le informazioni della locazione di scrittura di un settore disponibile successivo nell'area riservata per la scrittura di sostituzione come almeno un puntatore di posizione.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati mediante un supporto di registrazione comprendente almeno una area riservata all'interno di un'area dati; un'area temporanea di gestione dei difetti per la gestione di un'area difettosa all'interno dell'area dati; una porzione dell'almeno una area riservata in grado di memorizzare i dati di sostituzione,
in cui i dati scritti nell'area difettosa vengono sostituiti scrivendo i dati scritti nell'area difettosa sulla porzione dell'almeno una area riservata come dati di sostituzione; e le informazioni di gestione dei difetti nell'almeno una area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nella porzione dell'almeno una area riservata, in cui le informazioni di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata vengono identificate da almeno un puntatore di posizione.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati mediante un supporto di registrazione avente almeno una area riservata nell'area dati; un'area temporanea di gestione dei difetti per la gestione di un'area difettosa all'interno dell'area dati; una porzione dell'almeno una area riservata in grado di memorizzare i dati di sostituzione, in cui i dati scritti nell'area difettosa vengono sostituiti scrivendo i dati scritti nell'area difettosa sulla porzione dell'almeno una area riservata come dati di sostituzione; e le informazioni della lista dei difetti e le informazioni della struttura di definizione del disco nell'area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nella porzione dell'almeno una area riservata, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendono entry dei difetti corrispondenti ai dati di sostituzione effettivamente scritti, e le informazioni della struttura di definizione del disco comprendono le informazioni della locazione di scrittura di un settore disponibile successivo dell'almeno una area riservata per la scrittura di sostituzione come almeno un puntatore di posizione.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati grazie ad un apparecchio per la gestione di un supporto ottico di registrazione avente almeno una area temporanea di gestione dei difetti, ed almeno una area riservata in un'area dati, l'apparecchio comprendendo una combinazione di componenti per la sostituzione di dati scritti in un'area difettosa scrivendo i dati scritti nell'area difettosa sull'almeno una area riservata come dati di sostituzione qualora l'area difettosa venga individuata all'interno dell'area dati; e per la scrittura delle informazioni di gestione dei difetti nell'almeno una area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata, in cui le informazioni di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata sono identificate da almeno un puntatore di posizione.
Uno o più di questi e di altri aspetti dell'invenzione vengono realizzati grazie ad un apparecchio per la gestione di un supporto ottico di registrazione avente almeno una area temporanea di gestione dei difetti, ed almeno una area riservata in un'area dati, l'apparecchio comprendendo una combinazione di componenti per la sostituzione di dati scritti in un'area difettosa dell'area dati nell'almeno una area riservata piuttosto che nell'area difettosa come dati di sostituzione qualora l'area difettosa venga individuata all'interno dell'area dati; e per la generazione delle informazioni della lista dei difetti e delle informazioni della struttura di definizione del disco nell'almeno una area temporanea di gestione dei difetti per accedere ai dati scritti nell'area riservata come dati di sostituzione, e per la gestione delle informazioni della lista dei difetti e delle informazioni della struttura di definizione del disco, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendono entry dei difetti corrispondenti ai dati di sostituzione effettivamente scritti, e le informazioni della struttura di definizione del disco comprendono le informazioni della locazione di scrittura di un settore disponibile successivo nell'area riservata per la scrittura di sostituzione come almeno un puntatore di posizione.
Ulteriori ambiti di applicazione della presente invenzione diventeranno chiari a partire dalla descrizione dettagliata che da qui in avanti verrà data. Tuttavia, si intenda che la descrizione dettagliata e gli esempi specifici, pur indicando forme preferite di realizzazione dell'invenzione, sono riportati solamente a titolo di esempio, dal momento che modifiche e cambiamenti vari all'interno della logica e dell'ambito dell'invenzione diventeranno chiari a coloro che hanno esperienza nel settore a partire da questa descrizione dettagliata.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
Ulteriori obiettivi e vantaggi dell'invenzione possono essere pienamente compresi a partire dalla seguente dettagliata descrizione fornita in relazione con i disegni allegati, in cui:
La FIGURA 1 è una rappresentazione schematica di un dispositivo a disco ottico della relativa tecnica;
La FIGURA 2 è un diagramma a blocchi di un metodo della relativa tecnica per la gestione di un'area difettosa su un BD - RE;
La FIGURA 3 è un diagramma a blocchi di un dispositivo a disco ottico di registrazione e duplicazione secondo una forma di realizzazione della presente invenzione;
Le FIGURE 4 A e 4 B illustrano una struttura di un disco ottico BD - WO a singolo - strato e di un disco ottico BD - WO a doppio - strato, rispettivamente, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 5 è un diagramma a blocchi di un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma di realizzazione della presente invenzione.
La FIGURA 6 è un diagramma a blocchi di un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 7 è un diagramma a blocchi di un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 8 è un diagramma a blocchi delle informazioni della lista temporanea dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 9 è un diagramma a blocchi delle informazioni della lista temporanea dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 10 è un diagramma a blocchi delle informazioni della lista temporanea dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 11 è un diagramma a blocchi delle informazioni della lista temporanea dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 12 è un diagramma a blocchi che mostra le informazioni della struttura di definizione dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 13 è un diagramma a blocchi che mostra le informazioni della struttura di definizione dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 14 è un diagramma a blocchi che mostra le informazioni della struttura di definizione dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO a singolo - strato secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione;
La FIGURA 15 è un diagramma a blocchi che mostra le informazioni della struttura di definizione dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO a doppio - strato secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione; e
La FIGURA 16 è un diagramma a blocchi che mostra le informazioni della lista temporanea dei difetti scritte e gestite secondo un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO a singolo - strato e su un BD - WO a doppio - strato secondo un'altra forma preferita di realizzazione della presente invenzione.
MIGLIOR MODO PER IMPLEMENTARE L'INVENZIONE
Si farà adesso riferimento nel dettaglio alle forme preferite di realizzazione della presente invenzione, i cui esempi sono illustrati nei disegni allegati. Forme preferite di realizzazione della presente invenzione verranno descritte più dettagliatamente da qui in avanti, con riferimento alle FIGURE 3 - 16, e più in particolare con riferimento al dispositivo a disco ottico di registrazione e duplicazione 20 mostrato nella FIGURA 3.
La FIGURA 3 è un diagramma a blocchi di un dispositivo a disco ottico di registrazione e duplicazione 20 secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione. Il dispositivo a disco ottico di registrazione e / o duplicazione 20 (da qui in avanti dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione) comprende una testina ottica 22 per la scrittura e la lettura dei dati su e da un supporto ottico di registrazione 21, una servo unità 23 per controllare che la testina 22 mantenga una certa distanza tra la lente dell'obiettivo della testina 22 ed il supporto di registrazione 21 e per tracciare le relative tracce sul supporto di registrazione 21, un processore dati 24 per elaborare e fornire i dati in ingresso alla testina 22 per la scrittura, e per elaborare i dati letti dal supporto di memorizzazione 21, un’interfaccia 25 per scambiare dati e / o comandi con qualsiasi terminale esterno 30, una memoria o supporto di archiviazione 27 per memorizzarvi informazioni e dati contenenti i dati di gestione dei difetti associati al supporto di registrazione 21, ed un microprocessore o dispositivo di controllo 26 per controllare le operazioni e gli elementi del dispositivo di registrazione / duplicazione 20.
I dati che devono essere scritti o letti sul o dal supporto di registrazione 21 possono anche essere memorizzati nella memoria 27. Tutti i componenti del dispositivo di registrazione / duplicazione 20 sono funzionalmente accoppiati. Nella forma di realizzazione di esempio mostrata, il supporto di registrazione 21 è un supporto di registrazione del tipo scrivibile una sola volta, come ad esempio, un BD - WO.
Le FIGURE 4 A e 4 B illustrano una struttura di un disco ottico BD - WO a singolo - strato e di un disco ottico BD - WO a doppio - strato, rispettivamente, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. Come mostrato nelle FIGURE 4 A e 4 B, il BD - WO può avere uno o due strati di registrazione. Nella FIGURA 4 A, un BD - WO avente solo un singolo strato di registrazione (Strato 0) comprende un singolo strato di registrazione composto da un'area di lead - in (LIA), un'area dati, ed un'area di lead - out (LOA), ed è qui indicato come un disco a singolo - strato . Nella FIGURA 4 B, un BD - WO a doppio - strato comprende due strati di registrazione (Strato 0 e Strato 1) e verrà da qui in avanti indicato come un disco a doppio - strato. Il primo strato di registrazione (Strato 0) comprende una LIA, un'area dati, ed una zona esterna. Il secondo strato di registrazione (Strato 1) comprende una LOA, un'area dati ed una zona esterna, ed è qui indicato come un disco a doppio - strato. In genere, una scrittura dei dati nel disco a doppio - strato avviene nella direzione mostrata dalla freccia tratteggiata. Il disco a singolo - strato può avere una capacità di 23,3, 25,0 o 27,0 Gbyte, mentre il disco a doppio - strato può avere una capacità di 46,6, 50,0 o 54,0 Gbyte.
Si noti che tutte le diverse forme di realizzazione della presente invenzione, ad esempio, i vari metodi discussi da qui in avanti, sono applicabili a qualsiasi tipo di disco ottico, come ad esempio un BD - WO a singolo - strato, un BD - WO a doppio - strato o un BD - RE. Inoltre, sebbene l'uso del dispositivo di registrazione / duplicazione 20 della FIGURA 3 venga trattato di seguito, in relazione con i metodi dell'invenzione, l'invenzione non è limitata solo a questo e comprende altri dispositivi di registrazione / duplicazione fin tanto che vengano configurati per implementare i presenti metodi. Per esempio, il dispositivo mostrato nella FIGURA 1 può essere utilizzato per implementare i presenti metodi, se necessario.
La FIGURA 5 è un diagramma a blocchi di un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. In questo metodo, un'area difettosa su un BD - WO viene gestita in un modo simile ai metodi utilizzati per il BD - RE, in cui una nuova DFL Temporanea (TDFL) avente una dimensione di registrazione fissa pari a quattro cluster viene definita per essere applicata al BD - WO. Nel metodo di esempio per la gestione di un'area difettosa mostrato nella FIGURA 5, le entry dei difetti che vanno dalla prima sino alla terza D_Ent # 1 - # 3 generate durante un processo di scrittura di sostituzione durante una prima operazione di scrittura dei dati vengono scritte e gestite come informazioni della prima lista temporanea dei difetti (1ª_TDFL) di dimensione pari a quattro cluster.
Successivamente, viene aggiunta una quarta entry D_Ent # 4 generata durante un processo di scrittura di sostituzione durante una seconda operazione di scrittura dei dati, in maniera tale da scrivere e gestire le entry dei difetti che vanno dalla prima sino alla quarta D_Ent # 1 - # 4 come informazioni della seconda lista temporanea dei difetti (2ª_TDFL) di dimensione pari a quattro cluster. Inoltre, viene aggiunta una quinta entry D_Ent # 5 generata durante un processo di scrittura di sostituzione durante una terza operazione di scrittura dei dati, in maniera tale da scrivere e gestire le entry dei difetti che vanno dalla prima sino alla quinta D_Ent # 1 - # 5 come informazioni della terza lista temporanea dei difetti (3ª_TDFL) di dimensione pari a quattro cluster.
Tuttavia, se le operazioni che precedono vengono effettuate più volte, si può verificare un problema poiché una capacità di registrazione dei dati del BD - WO viene sprecata o comunque utilizzata in maniera inefficiente in quanto le informazioni della TDFL avente una dimensione di registrazione fissa pari a quattro cluster vengono scritte e riscritte più volte.
Il che vuol dire che, nel caso del BD - RE, l'utilizzo delle informazioni della lista dei difetti avente una dimensione di registrazione fissa pari a quattro cluster è irrilevante in quanto le informazioni della precedente lista dei difetti possono essere aggiornate come se il BD - RE fosse riscrivibile. Tuttavia, nel caso del BD - WO, una capacità di registrazione dei dati del BD - WO viene sprecata o utilizzata in maniera inefficiente in quanto una precedente lista dei difetti non può essere aggiornata nel BD - WO non riscrivibile (scrivibile una sola volta) e pertanto richiede la scrittura delle informazioni della nuova lista temporanea dei difetti. Pertanto, gli inventori della presente invenzione hanno stabilito che in questo tipo di sistema le informazioni della precedente lista dei difetti non possono essere aggiornate in maniera efficiente in questo formato.
La FIGURA 6 è un'altro diagramma a blocchi di un metodo per la gestione di un'area difettosa su un BD - WO secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione. Come si può vedere nella FIGURA 6, un BD - RE di esempio comprende un'area di lead - in (LIA), un'area dati ed un'area di lead - out (LOA). L'area dati comprende anche un'area dati utente dotata unitamente dei Numeri dei Settori Fisici ("Physical Sector Numbers", PSN) e dei Numeri dei Settori Logici ("Logical Sector Numbers", LSN), e aree dati non - utente ciascuna delle quali avente solamente i numeri dei settori fisici ad essa assegnati.
L'area dati non - utente comprende un'area riservata, ad esempio, un'area esterna riservata (OSA) per la scrittura dei dati piuttosto che un'area difettosa, ed una Area della Lista Temporanea dei Difetti (Area TDFL) per la scrittura delle informazioni di gestione sull'area difettosa ed dei dati scritti sull'area riservata. La OSA può essere allocata su una ISA, o la ISA può essere inoltre prevista per entrambe le locazioni. Allo stesso modo, l'area della TDFL può essere allocata su una posizione adiacente alla OSA, o può essere inoltre prevista per entrambe le locazioni.
Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 del dispositivo a disco ottico descritto con riferimento alla FIGURA 3 scrive i dati in maniera continua su un settore di scrittura predefinito nell'area dati utente durante la scrittura dei dati. Il settore di scrittura dei dati predefinito può essere impostato come una Unità di Verifica dei Difetti ("Defect Verify Unit", DVU) di una dimensione di registrazione equivalente ad una, o a più di una, traccia fisica o cluster in maniera tale da individuare l'area difettosa durante la scrittura dei dati.
Dopo la scrittura dei dati sulla DVU, il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 quindi ripete una serie di operazioni di individuazione delle aree difettose durante le quali il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 duplica i dati scritti nella DVU, e verifica che i dati siano stati scritti in maniera regolare. Ad esempio, dopo aver scritto in maniera continua i cluster che vanno dal primo sino al quinto (cluster # 1 - # 5) come una prima unità di verifica dei difetti DVU # 1 (S 10), il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 duplica i dati scritti in maniera progressiva sul DVU # 1, ed individua eventuali aree difettose.
Per esempio, e come mostrato nella FIGURA 6, qualora un'area difettosa viene individuata nel cluster # 2 (S 11), i dati nel cluster # 2 memorizzati nella memoria 27 o in un altro supporto di memorizzazione del dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 vengono temporaneamente scritti sulla OSA piuttosto che sull'area difettosa (S 12).
In questo caso, il cluster # 2 può essere scritto sulla OSA a partire sia dall'estremità posteriore che dall'estremità anteriore del cluster stesso. Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 duplica i dati scritti sulla DVU # 1 a partire dal cluster # 3 dopo l'operazione di scrittura. Per esempio, e come mostrato nella FIGURA 6, qualora esista un'area difettosa nel cluster # 4 (S 13), i dati nel cluster # 4 memorizzati nella memoria 27 o in un altro supporto di memorizzazione del dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 vengono temporaneamente scritti sulla OSA piuttosto che sull'area difettosa (S 14).
Pertanto, il DVU # 1 alla fine avrà i cluster # 1, # 3 e # 5 scritti su di essa in maniera regolare, e due aree difettose. Al contrario, la OSA ha i cluster # 2 e # 4 scritti su di essa piuttosto che sulle rispettive aree difettose.
Quando una registrazione dei dati avente una continuità temporanea (registrazione 1) termina nel mentre sono in corso l'individuazione dell'area difettosa di cui sopra e l'operazione di scrittura di sostituzione sul DVU # 1, DVU # 2,... DVU # n, il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 scrive, nell'area della TDFL, le informazioni di gestione come informazioni della TDFL per la gestione delle aree difettose e dei dati scritti piuttosto che sulle aree difettose.
In questo caso, le informazioni di gestione possono essere scritte e gestite come una TDFL in un esempio. Come mostrato nella FIGURA 7, la TDFL può includere una pluralità di entry dei difetti Entry_Difetto # 1 ... # m, ciascuna delle quali avente un numero del primo settore fisico dell'area difettosa (PSN del Difetto), un numero del primo settore fisico di un'area dati in cui vengono scritti i dati di sostituzione per l'area difettosa (PSN di Sostituzione), ed un riferimento tra di essi. Le informazioni della TDFL comprendono un primo settore fisico di ciascuna TDFL, ad esempio, PSN di TDFL # 1, una dimensione dell'area riservata e qualunque altra informazione di gestione se necessaria. Sia le informazioni della TDDS che le informazioni della TDFL vengono spostate e scritte in un'area di gestione dei difetti (DMA) del BD - WO come informazioni dell'area di gestione dei difetti nel momento in cui il BD - WO deve essere finalizzato o in un qualche istante di tempo definito.
Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 scrive nell'area della TDFL del BD - WO e gestisce le informazioni della lista temporanea dei difetti all'interno di una dimensione di registrazione predefinita inferiore a quattro cluster, come ad esempio, una dimensione di registrazione pari ad un cluster. Per esempio, come mostrato nella FIGURA 8, il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 scrive nell'area della TDFL e gestisce le entry dei difetti che vanno dalla prima sino alla terza D_Ent # 1 - # 3 generate a partire da un processo di scrittura di sostituzione durante una prima operazione di scrittura dei dati come informazioni della prima lista temporanea dei difetti (1ª_TDFL) di dimensione pari ad un cluster. Le informazioni della prima lista temporanea dei difetti (1ª_TDFL) comprendono anche le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add) della zona dell'area riservata che è disponibile per riscritture successive. Per esempio, le informazioni della locazione di scrittura della ISA avente una possibile, successiva locazione di scrittura di sostituzione vengono inserite nella prima lista temporanea dei difetti (1ª_TDFL). Queste informazioni della locazione di scrittura servono come un puntatore di posizione che indirizza il processo di gestione dei difetti sulle appropriate locazioni dell'area dati.
Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 poi aggiunge una quarta entry dei difetti D_Ent # 4 generata a partire da un processo di scrittura di sostituzione durante una seconda operazione di scrittura dei dati in maniera tale da formare dalla prima sino alla quarta entry D_Ent # 1 - # 4. Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 scrive nell'area TDFL e gestisce le entry che vanno dalla prima sino alla quarta D_Ent # 1 - # 4 come informazioni della seconda lista temporanea dei difetti (2ª_TDFL) di dimensione pari ad un cluster. Le informazioni della seconda lista temporanea dei difetti (2ª_TDFL) comprendono inoltre le informazioni della nuova locazione di scrittura per la locazione successiva di scrittura di sostituzione della ISA qualora essa sia disponibile.
Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 poi aggiunge una quinta entry dei difetti D_Ent # 5 generata a partire da un processo di scrittura di sostituzione durante una terza operazione di scrittura dei dati a formare dalla prima sino alla quinta entry D_Ent # 1 - # 5. Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 poi scrive nell'area della TDFL e gestisce le entry che vanno dalla prima sino alla quinta D_Ent # 1 - # 5 come informazioni della terza lista temporanea dei difetti (3ª_TDFL) di dimensione pari ad un cluster. Le informazioni della terza lista temporanea dei difetti (3ª_TDFL) comprendono inoltre le informazioni della nuova locazione di scrittura per la locazione successiva di scrittura di sostituzione della ISA qualora essa sia disponibile.
Pertanto, poiché le informazioni della lista dei difetti comprendono solo le entry dei difetti per accedere ai dati di sostituzione effettivamente scritti nell'area riservata, e le informazioni della locazione di scrittura per le locazioni successive di scrittura di sostituzione dell'area riservata qualora disponibile, una dimensione di registrazione delle informazioni della lista dei difetti può essere limitata ad un cluster. Di conseguenza, tale(i) puntatore(i) di posizione serve (servono) a ridurre lo spazio richiesto per le informazioni di gestione dei difetti.
La FIGURA 9 mostra un esempio di scrittura delle informazioni di gestione dei difetti su un BD - WO quando una delle aree riservate, ad esempio, una ISA, è piena di dati di sostituzione. Con riferimento alla FIGURA 9, il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione 20 scrive le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add) per la scrittura di sostituzione successiva (qualora possibile) sulla lista dei difetti. Il dispositivo a disco ottico di registrazione / duplicazione scrive i dati di sostituzione in una direzione opposta rispetto alla direzione di scrittura di sostituzione dei dati nella OSA in cui i dati vengono scritti, ad esempio, partendo da una parte più esterna verso una parte più interno.
Con riferimento alla FIGURA 10, quando le informazioni della TDFL che devono essere nuovamente scritte superano una dimensione di registrazione pari ad un cluster per via dell'incremento delle entry dei difetti durante la generazione delle informazioni della TDFL di dimensione pari ad un cluster, la dimensione di registrazione della TDFL appena generata viene da quel momento in poi estesa a due cluster secondo una prima forma di realizzazione della presente invenzione. Per esempio, quando la terza TDFL (TDFL # 3) di dimensione pari ad un cluster è piena delle informazioni della TDFL scritte come sopra discusso, la dimensione allocata di ogni successiva TDFL viene estesa, ad esempio, a 2 cluster, per adeguarsi all'incremento delle informazioni della TDFL. In questo modo, la dimensione allocata di ciascuna TDFL può essere estesa ulteriormente come dimensione di registrazione, se necessario, ad esempio, da 2 a 4 cluster.
Come si può vedere in una seconda forma di realizzazione mostrata nella FIGURA 11, quando le informazioni della TDFL che devono essere nuovamente scritte superano la dimensione di registrazione pari ad un cluster per via di un incremento delle entry dei difetti durante la scrittura delle informazioni della TDFL nel primo cluster, un record delle entry dei difetti precedentemente scritto viene tralasciato dalle informazioni della nuova TDFL, ad esempio, nella quarta TDFL (TDFL # 4). Contemporaneamente, nel mentre le informazioni della nuova TDFL vengono scritte in un cluster, nuove entry dei difetti e informazioni della locazione di scrittura delle locazioni successive di scrittura di sostituzione dell'area riservata (qualora possibile) vengono su di essa scritte. In questo modo, la dimensione di ciascuna TDFL può essere, come da allocazione, mantenuta ad un valore pari od inferiore ad un cluster.
Le informazioni della TDFL contenenti le nuove entry dei difetti, e le informazioni della TDFL scritte precedentemente vengono raggruppate in un primo gruppo (Gruppo # 1) ed in un secondo gruppo (Gruppo # 2). Le informazioni di identificazione per identificare il primo gruppo ed il secondo gruppo, ad esempio, l'indice del gruppo (Indice_Gruppo), vengono inserite con le informazioni della TDDS che vengono scritte in un'area designata della TDDS del BD - WO, ad esempio, l'area della TDDS nella LIA mostrata nella FIGURA 6.
Di conseguenza, il dispositivo a disco ottico è in grado di eseguire la regolare gestione dell'area difettosa e l'operazione di scrittura di sostituzione con riferimento alle entry dei difetti nelle informazioni della TDFL e nelle informazioni della locazione di scrittura delle locazioni successive dell'area riservata per la scrittura di sostituzione (qualora disponibile). In aggiunta, il dispositivo a disco ottico è in grado di scrivere e gestire le informazioni della TDFL utilizzando una dimensione di registrazione che sia la più piccola possibile.
Si noti che le informazioni della TDFL possono essere scritte in qualsiasi specifica area del supporto di registrazione, e spostate su un'area definitiva di gestione dei difetti (DMA) sul BD - WO come informazioni della DFL. Inoltre, le informazioni della TDDS possono anche essere allocate su una qualsiasi specifica area del supporto di registrazione, e spostate sulla DMA come informazioni della DDS.
La presente invenzione per la scrittura e la gestione di entry dei difetti minime e di informazioni della locazione di scrittura per le locazioni successive di scrittura di sostituzione (qualora possibile) è applicabile non solo al BD - WO descritto sopra e mostrato nelle figure allegate, ma anche ad una varietà di altri supporti di registrazione, come ad esempio, i BD-RW.
Come si può vedere in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione mostrata nella FIGURA 12, le entry dei difetti minime, e le informazioni di identificazione per indicare la fine o la terminazione della scrittura delle entry dei difetti, come ad esempio, le informazioni del terminatore della lista dei difetti ("Terminatore della Lista dei Difetti", Defect List Terminator) avente dimensione di registrazione pari a 8 byte, vengono scritte e gestite nella prima TDFL (TDFL # 1). Le informazioni della locazione di scrittura delle locazioni successive di scrittura di sostituzione nell'area riservata (qualora disponibile) vengono scritte e gestite nelle informazioni della prima TDDS (TDDS # 1) corrispondenti alle informazioni della prima TDFL.
Inoltre, per esempio, nell'area riservata di esempio di un BD - WO mostrato, le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_riservato_disponibile) corrispondenti ad un primo settore del primo cluster successivo disponibile per la scrittura di sostituzione ed il numero del primo settore fisico (il PSN del primo settore) per accedere alle informazioni della prima TDFL (PSN della TDFL # 1) vengono inserite nelle informazioni della prima TDDS.
Inoltre, come mostrato nella FIGURA 13, quando le nuove informazioni della seconda TDFL (TDFL # 2) vengono aggiornate, le nuove entry dei difetti, e le informazioni del terminatore della lista dei difetti indicante la terminazione della scrittura della lista dei difetti vengono scritte nelle informazioni della seconda TDFL (TDFL # 2).
Inoltre, le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_riservato_disponibile) corrispondente ad un primo settore del primo cluster dell'area riservata disponibile per la scrittura di sostituzione successiva ed il numero del primo settore fisico per accedere alle informazioni della seconda TDFL (PSN della TDFL # 2) vengono inseriti nella seconda TDDS corrispondente alle informazioni della seconda TDFL.
Di conseguenza, le informazioni della TDDS (TDDS # k) comprendono un numero di settore fisico per accedere alle informazioni della TDFL appena scritte (PSN della TDFL # k) e le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_riservato_disponibile) corrispondente ad un primo settore del primo cluster dell'area riservata disponibile per la scrittura di sostituzione successiva.
Con riferimento alla FIGURA 14, nel caso di un BD - WO avente un singolo strato e avente sia la ISA che la OSA, la TDDS (TDDS # k) comprende le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_ISA0_disponibile) corrispondente ad un primo settore del primo cluster della ISA disponibile per la scrittura di sostituzione successiva, e le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_OSA0_disponibile) corrispondenti ad un primo settore del primo cluster della OSA disponibile per la scrittura di sostituzione successiva.
Come si può vedere nella FIGURA 14, se i dati di sostituzione scritti nella OSA vengono scritti in una direzione che si estende da una circonferenza più esterna verso una circonferenza più interna del disco ottico, allora le informazioni della locazione di scrittura di un ultimo settore di un cluster di fronte agli ultimi dati di sostituzione scritti vengono scritte e gestite come informazioni della locazione di scrittura della OSA disponibile per la scrittura di sostituzione successiva.
Come si può vedere nella FIGURA 15, nel caso di un BD - WO a doppio - strato avente aree interne riservate (ISA 0, e ISA 1) ed aree esterne riservate (OSA 0, e OSA 1) rispettivamente allocate sul primo strato (Strato 0) e sul secondo strato (Strato 1), le informazioni della TDDS (TDDS # K) comprendono le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_ISA0_disponibile, e 1º_cluster_ISA1_disponibile) corrispondenti ai primi settori dei primi cluster della prima e della seconda area interna riservata disponibile come settori successivi di scrittura di sostituzione, e le informazioni della locazione di scrittura (1º_cluster_OSA0_disponibile, e 1º_cluster_OSA1_disponibile) corrispondenti ai primi settori dei primi cluster della prima e della seconda area esterna riservata disponibile come settori successivi di scrittura di sostituzione per la gestione dei difetti. Questi frammenti di informazione della locazione di scrittura possono essere scritti nell'ordine indicato o in diverso ordine.
Come si può vedere nella FIGURA 16, anche nel caso in cui le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add) dell'area riservata disponibile per la scrittura di sostituzione successiva vengono scritte e gestite nelle informazioni della TDFL come descritto con riferimento alle FIGURE 7 - 11, se il BD - WO ha un singolo strato con entrambe la ISA e la OSA su di esso allocate (come mostrato nella FIGURA 16), le informazioni della TDFL comprendono le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add_ISA) identificanti un primo settore di un primo cluster della ISA disponibile per la scrittura di sostituzione successiva e le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add_OSA) identificanti un primo settore di un primo cluster della OSA disponibile per la scrittura di sostituzione successiva per la gestione dei difetti.
Inoltre, nel caso di un BD - WO avente un doppio - strato con aree interne riservate (ISA 0, e ISA 1) ed aree esterne riservate (OSA 0, e OSA 1) rispettivamente allocate sul primo strato (Strato 0) e sul secondo strato (Strato 1), le informazioni della TDFL comprendono le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add_ISA0, e disponibile_Add_ISA1) identificanti i primi settori dei primi cluster della prima e della seconda area interna riservata disponibile come settori successivi di scrittura di sostituzione, e le informazioni della locazione di scrittura (disponibile_Add_OSA0, e disponibile_Add_OSA1) identificanti i primi settori dei primi cluster della prima e della seconda area esterna riservata disponibile per la scrittura di sostituzione successiva per la gestione dei difetti per, rispettivamente, entrambi gli strati interno ed esterno. Questi frammenti di informazione della locazione di scrittura possono essere scritti nell'ordine indicato o in diverso ordine.
In un'altra forma di realizzazione, le informazioni della locazione di scrittura identificanti il settore disponibile in una o più aree riservate possono essere scritte nella TDFL e nella TDDS se lo si desidera.
Di conseguenza, il dispositivo a disco ottico di registrazione e duplicazione 20 è in grado di implementare la regolare gestione dell'area difettosa e le operazioni di scrittura di sostituzione con riferimento alle entry dei difetti nelle informazioni della TDFL e scrivere le informazioni della locazione di scrittura nelle informazioni della TDDS e / o nelle informazioni della TDFL, e può scrivere e gestire le informazioni della TDFL utilizzando una dimensione di registrazione delle aree riservate che sia la più piccola possibile.
APPLICABILITÀ INDUSTRIALE
Come è stato descritto, il metodo per la gestione di un'area difettosa su un disco ottico ad alta densità del tipo scrivibile una sola volta consente la scrittura e la gestione più efficiente delle informazioni della lista dei difetti o delle informazioni della lista temporanea dei difetti per la gestione dell'area difettosa in una dimensione di registrazione minima, mediante la scrittura dei dati di un'area difettosa già esistente su un disco ottico ad alta densità, come un BD - WO, in un'area riservata piuttosto che su un'area difettosa, generando le informazioni della lista dei difetti per accedere ai dati di sostituzione scritti nell'area riservata e mediante la scrittura in una specifica area di gestione, in cui le entry dei difetti corrispondenti ai dati di sostituzione effettivamente scritti, e le informazioni della locazione di scrittura della scrittura di sostituzione successiva della relativa area riservata vengono scritte e gestite come informazioni della lista dei difetti per la gestione, o le informazioni della locazione di scrittura di cui è possibile la scrittura di sostituzione vengono scritte e gestite nelle informazioni della struttura di definizione dei difetti.
Sarà chiaro per coloro che hanno esperienza nel settore che nella presente invenzione possono essere fatte varie modifiche e variazioni rimanendo tuttavia fedeli all'ambito dell'invenzione. Per cui, si presume che la presente invenzione copra le modifiche e le variazioni della presente invenzione ammesso che esse rientrino nell'ambito delle rivendicazioni allegate e di ciò che ad esse è equivalente.
RIVENDICAZIONI
1. Metodo per registrare informazioni di gestione su un supporto ottico di registrazione avente un'area di lead - in, un'area dati ed un'area di lead - out, l'area dati avendo un'area riservata che è utilizzata per la scrittura di sostituzione,
caratterizzato dal fatto che
il supporto ottico di registrazione (21) è composto da un'area temporanea di gestione dei difetti che è utilizzata fin tanto che il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato e da un'area definitiva di gestione dei difetti che è utilizzata nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato e
detto metodo comprendendo le fasi di:
(a) sostituire un'area difettosa esistente sull'area dati scrivendo i dati di sostituzione dell'area difettosa nell'area riservata;
(b) scrivere, nell'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni temporanee di gestione dei difetti per accedere ai dati di sostituzione scritti nell'area riservata ed almeno un puntatore di posizione per accedere alle informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti, e
(c) scrivere, nell'area definitiva di gestione dei difetti, le informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre:
scrivere, nell'area temporanea di gestione dei difetti, informazioni della locazione indicanti una locazione disponibile successiva all'interno dell'area riservata per la scrittura di sostituzione successiva.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la fase (b) comprende scrivere, nell'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni della lista dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente ai dati di sostituzione come le informazioni temporanee di gestione dei difetti.
4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendono un terminatore della lista dei difetti in maniera tale da indicare una estremità delle entry dei difetti incluso nelle informazioni della lista dei difetti, in cui nella fase di (b) le informazioni della lista dei difetti comprendenti il terminatore della lista dei difetti vengono scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti.
5. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui le informazioni della locazione sono un numero del primo settore fisico della locazione disponibile successiva.
6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui il supporto ottico di registrazione (21) ha una pluralità di aree riservate, in cui le informazioni della locazione sono scritte per area riservata.
7. Metodo secondo una delle rivendicazioni 2, 5 e 6, comprendente inoltre:
scrivere nuovi dati di sostituzione per una nuova area difettosa nella locazione disponibile successiva indicata dalle informazioni della locazione; e
scrivere nuove informazioni della locazione indicanti una nuova locazione disponibile successiva all'interno dell'area riservata nell'area temporanea di gestione dei difetti.
8. Metodo secondo la rivendicazione 7, comprendente inoltre scrivere le nuove informazioni temporanee di gestione dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente alla nuova area difettosa.
9. Supporto di registrazione avente un'area di lead - in, un'area dati ed un'area di lead - out, l'area dati avendo un'area riservata che è utilizzata per memorizzare dati di sostituzione per una esistente area difettosa sull'area dati,
caratterizzato da
un'area temporanea di gestione dei difetti ivi memorizzante le informazioni temporanee di gestione dei difetti per accedere ai dati di sostituzione scritti nell'area riservata ed almeno un puntatore di posizione per accedere alle informazioni temporanee di gestione dei difetti memorizzate nell'area temporanea di gestione dei difetti fin tanto che il supporto di registrazione (21) deve essere finalizzato, e
un'area definitiva di gestione dei difetti ivi memorizzante le informazioni di gestione dei difetti, che vengono scritte dall'area temporanea di gestione dei difetti nell'area definitiva di gestione dei difetti, nel momento in cui il supporto di registrazione (21) deve essere finalizzato.
10. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 9, in cui l'area temporanea di gestione dei difetti altresì vi memorizza le informazioni della locazione indicanti una locazione disponibile successiva all'interno dell'area riservata per la scrittura di sostituzione successiva.
11. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente all'area difettosa vengono memorizzate come le informazioni temporanee di gestione dei difetti nell'area temporanea di gestione dei difetti.
12. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 9, in cui le informazioni della locazione sono un numero del primo settore fisico della locazione disponibile successiva.
13. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 9, in cui il supporto ottico di registrazione ha una pluralità di aree riservate, in cui l'area temporanea di gestione dei difetti vi memorizza le informazioni della locazione per area riservata.
14. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 9, in cui il supporto di registrazione (21) è un disco Blu - ray del tipo scrivibile una sola volta (BD - WO).
15. Supporto di registrazione secondo la rivendicazione 11, in cui le informazioni della lista dei difetti hanno una dimensione di registrazione non superiore ai quattro cluster.
16. Apparecchio per registrare informazioni di gestione su un supporto ottico di registrazione avente un'area di lead - in, un'area dati ed un'area di lead - out, l'area dati avendo un'area riservata che è utilizzata per la scrittura di sostituzione,
caratterizzato dal fatto che
il supporto ottico di registrazione (21) è composto da un'area temporanea di gestione dei difetti che è utilizzata fin tanto che il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato ed da un'area definitiva di gestione dei difetti che è utilizzata nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato; e
detto apparecchio è composto da:
una testina (22) configurata per scrivere o duplicare dati sul o dal supporto ottico di registrazione (21); e
un dispositivo di controllo (26) funzionalmente accoppiato alla testina (22) e configurato per sostituire una esistente area difettosa sull'area dati controllando che la testina (22) scriva i dati di sostituzione per l'area difettosa nell'area riservata; per controllare che la testina (22) scriva, nell'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni temporanee di gestione dei difetti per accedere ai dati di sostituzione scritti nell'area riservata ed almeno un puntatore di posizione per accedere alle informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti; e per controllare che la testina (22) scriva, nell'area definitiva di gestione dei difetti, le informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato.
17. Apparecchio secondo la rivendicazione 16, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva le informazioni della locazione indicanti una locazione disponibile successiva all'interno dell'area riservata per la scrittura di sostituzione successiva.
18. Apparecchio secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva, all'interno dell'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni della lista dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente all'area difettosa come le informazioni temporanee di gestione dei difetti.
19. Apparecchio secondo la rivendicazione 18, in cui le informazioni della lista dei difetti comprendono un terminatore della lista dei difetti per indicare una estremità delle entry dei difetti incluso nelle informazioni della lista dei difetti, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva le informazioni della lista dei difetti comprendenti il terminatore della lista dei difetti nell'area temporanea di gestione dei difetti.
20. Apparecchio secondo la rivendicazione 17, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva un numero del primo settore fisico della locazione disponibile successiva come l'informazione della locazione.
21. Apparecchio secondo la rivendicazione 17, in cui il supporto ottico di registrazione (21) ha una pluralità di aree riservate, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva le informazioni della locazione per area riservata.
22. Apparecchio secondo una delle rivendicazioni 17, 20 e 21, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva i nuovi dati di sostituzione per una nuova area difettosa sulla locazione disponibile successiva indicata dalle informazioni della locazione, e per controllare che la testina (22) scriva le nuove informazioni della locazione indicanti una nuova locazione disponibile successiva all'interno dell'area riservata nell'area temporanea di gestione dei difetti.
23. Apparecchio secondo la rivendicazione 22, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina (22) scriva le nuove informazioni temporanee di gestione dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente alla nuova area difettosa nell'area temporanea di gestione dei difetti.
24. Metodo per duplicare informazioni di gestione da un supporto ottico di registrazione avente un'area di lead - in, un'area dati ed un'area di lead - out, l'area dati avendo un'area riservata che è utilizzata per la scrittura di sostituzione,
caratterizzato dal fatto che
il supporto ottico di registrazione (21) è composto da un'area temporanea di gestione dei difetti che è utilizzata fin tanto che il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato e da un'area definitiva di gestione dei difetti che è utilizzata nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato, e detto metodo comprende le fasi di:
(a) duplicare almeno un puntatore di posizione per accedere alle informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti;
(b) duplicare le informazioni temporanee di gestione dei difetti per accedere ai dati di sostituzione per una esistente area difettosa sull'area dati mediante il puntatore di posizione prima che il supporto ottico di registrazione (21) venga finalizzato; e
(c) duplicare i dati di sostituzione dall'area riservata piuttosto che dai dati scritti nell'area difettosa mediante l'area temporanea di gestione dei difetti.
25. Metodo secondo la rivendicazione 24, che comprende inoltre duplicare, dall'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni della locazione indicanti una locazione disponibile successiva dell'area riservata per la scrittura di sostituzione successiva.
26. Metodo secondo la rivendicazione 24 o 25, in cui la fase di (b) comprende duplicare le informazioni della lista dei difetti comprendente una entry dei difetti corrispondente all'area difettosa come le informazioni temporanee di gestione dei difetti.
27. Metodo secondo la rivendicazione 26, comprendente duplicare il terminatore della lista dei difetti incluso nelle informazioni della lista dei difetti, il terminatore della lista dei difetti indicando una estremità delle entry dei difetti inclusa nelle informazioni della lista dei difetti.
28. Metodo secondo la rivendicazione 25, in cui il supporto ottico di registrazione (21) ha una pluralità di aree riservate, in cui le informazioni della locazione sono riprodotte per area riservata.
29. Metodo secondo la rivendicazione 24, comprendente inoltre:
duplicare le informazioni di gestione dei difetti scritte nell'area definitiva di gestione dei difetti dopo che il supporto di registrazione (21) è stato finalizzato.
30. Apparecchio per duplicare informazioni di gestione da un supporto ottico di registrazione avente un'area di lead - in, un'area dati ed un'area di lead - out, l'area dati avendo un'area riservata che è utilizzata per la scrittura di sostituzione,
caratterizzato dal fatto che
il supporto ottico di registrazione (21) è composto da un'area temporanea di gestione dei difetti che è utilizzata fin tanto che il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato e da un'area definitiva di gestione dei difetti che è utilizzata nel momento in cui il supporto ottico di registrazione (21) deve essere finalizzato, e detto apparecchio è composto da:
una testina (22) configurata per duplicare i dati dal supporto ottico di registrazione (21); e
un dispositivo di controllo (26) funzionalmente accoppiato alla testina e configurato per controllare che la testina duplichi almeno un puntatore di posizione per accedere alle informazioni temporanee di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti; per controllare che la testina duplichi le informazioni temporanee di gestione dei difetti per accedere ai dati di sostituzione per una esistente area difettosa sull'area dati mediante il puntatore di posizione prima che il supporto ottico di registrazione (21) venga finalizzato; e controllare che la testina duplichi i dati di sostituzione dall'area riservata piuttosto che i dati scritti nell'area difettosa mediante l'area temporanea di gestione dei difetti.
31. Apparecchio secondo la rivendicazione 30, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina duplichi, dall'area temporanea di gestione dei difetti, le informazioni della locazione indicanti una locazione disponibile successiva dell'area riservata per la scrittura di sostituzione successiva.
32. Apparecchio secondo la rivendicazione 30 o 31, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina duplichi le informazioni della lista dei difetti comprendenti una entry dei difetti corrispondente all'area difettosa come le informazioni temporanee di gestione dei difetti.
33. Apparecchio secondo la rivendicazione 32, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina duplichi il terminatore della lista dei difetti incluso nelle informazioni della lista dei difetti, il terminatore della lista dei difetti indicando una estremità delle entry dei difetti inclusa nelle informazioni della lista dei difetti.
34. Apparecchio secondo la rivendicazione 31, in cui il supporto ottico di registrazione (21) ha una pluralità di aree riservate, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina duplichi le informazioni della locazione per area riservata.
35. Apparecchio secondo la rivendicazione 30, in cui il dispositivo di controllo (26) è configurato per controllare che la testina duplichi le informazioni di gestione dei difetti scritte nell'area temporanea di gestione dei difetti dopo che il supporto di registrazione (21) è stato finalizzato.
Da Inglese a Italiano: Method And System For Lithographic Mask Inspection (by Synopsys, Inc. US) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese METHOD AND SYSTEM FOR LITHOGRAPHIC MASK INSPECTION
Description
1. The Background of the Invention
a. The Field of the Invention
This invention relates to the field of integrated circuit manufacturing. In particular, the invention relates to a system for inspection of defects on masks used in the manufacture of integrated circuits.
b. Description of Related Art
In designing an integrated circuit (IC), engineers typically rely upon computer simulation tools to help create a circuit schematic design consisting of individual devices coupled together to perform a certain function. To actually fabricate this circuit in a semiconductor substrate the circuit must be translated into a physical representation, or layout, which itself can then be transferred onto a template (i.e., mask), and then to the silicon surface. Again, computer aided design (CAD) tools assist layout designers in the task of translating the discrete circuit elements into shapes which will embody the devices themselves in the completed IC. These shapes make up the individual components of the circuit, such as gate electrodes, field oxidation regions, diffusion regions, metal interconnections, and so on.
Once the layout of the circuit has been created, the next step to manufacturing the integrated circuit (IC) is to transfer the layout onto a semiconductor substrate. One way to do this is to use the process of optical lithography in which the layout is first transferred onto a physical template which is in turn used to optically project the layout onto a silicon wafer.
In transferring the layout to a physical template, a mask (usually a quartz plate coated with chrome) is generally created for each layer of the integrated circuit design. This is done by inputting the data representing the layout design for that layer into a device such as an electron beam machine which writes the integrated circuit layout pattern into the mask material. In less complicated and dense integrated circuits, each mask comprises the geometric shapes which represent the desired circuit pattern for its corresponding layer. In more complicated and dense circuits in which the size of the circuit features approach the optical limits of the lithography process, the masks may also comprise optical proximity correction features such as serifs, hammerheads, bias and assist bars which are sublithographic sized features designed to compensate for proximity effects. In other advanced circuit designs, phase shifting masks may be used to circumvent certain basic optical limitations of the process by enhancing the contrast of the optical lithography process.
These masks are then used to optically projected the layout onto a silicon wafer coated with photoresist material. For each layer of the design, a light is shone on the mask corresponding to that layer via a visible light source or an ultra-violet light source. This light passes through the clear regions of the mask, whose image exposes the underlying photoresist layer, and is blocked by the opaque regions of the mask, leaving that underlying portion of the photoresist layer unexposed. The exposed photoresist layer is then developed, typically through chemical removal of the exposed/non-exposed regions of the photoresist layer. The end result is a semiconductor wafer coated with a photoresist layer exhibiting a desired pattern which defines the geometries, features, lines and shapes of that layer. This process is then repeated for each layer of the design.
As integrated circuit designs become more complicated, it becomes increasingly important that the masks used in photolithography are accurate representations of the original design layout. It is, unfortunately, unrealistic to assume that the electron beam and other machines used to manufacture these masks can do so without error. In the typical manufacturing process, some mask defects do occur outside the controlled process.
A defect on a mask is anything that is different from the design database and is deemed intolerable by an inspection tool or an inspection engineer. Figs.1(a)-(f), illustrate a mask 100 representing a simple integrated circuit design which contains some of the common mask defects that occur during the mask manufacturing process. The mask 100 comprises an opaque area 105, typically made of chrome, and clear areas 110 and 120 which represent the geometry primitives to be transferred onto the photoresist layer, and typically made of quartz. Fig. 1(a) illustrates an isolated pinhole defect 125 in the opaque area 105 of the mask 100. Fig. 1(b) illustrates an isolated opaque spot defect 130 in the clear area 110 of the mask 100. Fig. 1(c) illustrates edge intrusion defects 140 in the clear areas 110 and 120 of the mask 100. Fig. 1(d) illustrates edge protrusion defects 145 in the opaque area 105 of the mask 100. Fig. 1(e) illustrates a geometry break defect 150 in the clear area 110 of the mask 100. Finally, Fig. 1(f) illustrates a geometry bridge defect 155 in the opaque area 105 of the mask 100.
Figs. 2(a)-(b) illustrate possible defects which may occur on a mask which utilizes optical proximity correction features. Fig. 2(a) illustrates a simple desired mask design 200 consisting of an opaque area 205, a clear area 210 which represents the shape desired to be transferred to the photoresist, and design serifs 215 which are added to the design to correct for optical proximity effects. Fig. 2(b) illustrates the mask 220 which could be produced by a typical electron beam machine given the mask design 200 as an input. The mask 220 comprises an opaque area 225, a clear area 230, and modified serifs 235. Note that the shape of the modified serifs 235 is different than the shape of the design serifs 215. This is because the size of the serifs is very small -- they are designed to be smaller than the optical resolution of the lithography process to be used -- and the electron beam typically can not perfectly reproduce the design serif 215 shape onto the mask material. The result would be similar for masks which utilize other optical proximity correction features such as hammerheads, bias bars and assist bars.
One typical method of inspecting a mask for defects such as those illustrated in Figs. 1 and 2 is illustrated in the flowchart of Fig. 3. After designing an integrated circuit 300 and creating a data file of mask design data 310, the mask design data is provided to a device such as an electron beam or laser writing machine and a mask is manufactured 315. The mask is then inspected for defects as shown at process block 320. The inspection may, for instance, be carried out by scanning the surface of the mask with a high resolution microscope (e.g., optical, scanning electron, focus ion beam, atomic force, and near-field optical microscopes) and capturing images of the mask. These mask images may then be observed by engineers off-line or mask fabrication workers online to identify defects on the physical mask. The next step, shown as decision block 325, is determining whether or not the inspected mask is good enough for use in the lithography process. This step can be performed offline by a skilled inspection engineer, or by fabrication workers online possibly with the aid of inspection software. If there are no defects, or defects are discovered but determined to be within tolerances set by the manufacturer or end-user, then the mask is passed and used to expose a wafer as shown at process block 340. If defects are discovered that fall outside tolerances, then the mask fails the inspection 325, and a decision 330 must be made as to whether the mask may be cleaned and/or repaired to correct the defects 335, or whether the defects are so severe that a new mask must be manufactured 315. This process is continued until a manufactured mask passes the inspection 325.
Once a physical mask is produced which passes the inspection, it is important to further inspect the mask to ensure that the mask will produce the desired image on a photoresist after a wafer is exposed to light through the mask. This is typically performed by undertaking the costly step of actually exposing and processing a wafer using the mask that is being inspected as shown at process block 340. The processed wafer is then inspected at block 345, and a decision 350 is made to determine whether there are any defects and whether the defects fall within tolerances. If discovered defects are substantial, then, as before, it is determined 330 whether the defects can be repaired 335 or whether a new mask must be produced 315. This process is continued until a mask is manufactured that will produce desired wafer patterns and that will pass the wafer level inspection shown at block 350. This mask is then used in the lithography process to expose the corresponding layer in the overall manufacturing process.
However, not all mask defects are important with respect to the desired end result -- the end result being an accurate representation of the original design layout on the photoresist material or etched into silicon. This is because not all mask defects will "print." Loosely speaking, the printability of a defect is how a defect would impact the outcome of a given photolithography and/or etching process. The importance of printability now becomes apparent, because the goal of defect inspection is to correctly identify a defect in order to avoid a failed wafer processing. Since printability of a defect is mainly associated with the stepper exposure, it depends on the particular stepper exposure conditions. Therefore to say a defect is "not printable" means that it has little effect on the expected outcome of a particular stepper exposure, even though it may become "printable" under a different set of stepper exposure conditions. Put in a different way, printability is highly dependent on the stepper conditions, because a defect may print under one set of conditions, but not another. These conditions include: defect size, wavelength, numerical aperture, coherence factor, illumination mode, exposure time, exposure focus/defocus, and the reflection/transmission characteristics of the defect among others.
Currently, inspection tools that are in use include tools which inspect masks both on-line (ie. within the production line) and off-line. Conventional on-line inspection tools typically scan the entire mask area looking for defect areas, and some may also compare the inspected result with the mask layout database when defects are detected. However, the defect analysis of the typical on-line inspection tools are based primarily (or solely) on the size of the defect picked up by the optics to define the severity of a particular defect. While this scheme has been somewhat successful in the past, today's masks are designed with smaller and smaller features, using advanced and unconventional methods such as OPC. Due to these changes, conventional methods of inspection are rapidly proving to be inadequate because they do not address several issues.
First, whether a defect prints or not greatly depends on both its location and size, not just size or transmission/reflection characteristics alone. For example, a large defective spot in an isolated area may have little or no effect on the current and subsequent process layers. On the other hand, a small spot near a corner or an edge, or critical area should not be dismissed without closer examination. This is true for both conventional binary masks and advanced masks. Second, advanced OPC mask features can trigger false defect detections. The typical conventional scheme can falsely report an OPC feature or an imperfect OPC feature (e.g., rounded serifs as illustrated in Fig. 2) as a defect, when it actually has little impact on the end result. Although some existing mask inspection tools have a sliding scale setting to "tolerate" OPC features, this is not a robust method since defects associated with these special features may be overlooked because of this arbitrary scale. Additionally, OPC features are typically designed for a specific set of stepper parameters, but conventional tools' sliding scales are blind to these optical parameters.
Third, phase information is not properly incorporated into consideration, if at all, in the typical conventional defect inspection scheme. Therefore, phase shifting masks are not properly inspected. Finally, even though a defect may not appear to print, it might affect the process latitude in a way that will decrease yield and not be detected by conventional on-line defect inspection systems.
On the other hand, off-line inspection stations, which either scan for defects directly or review previously stored undeterminable defect data from an on-line tool, also face the same issues. In addition, these issues may require expensive engineers' time to be resolved, and thus diminish throughput while raising cost. Although with an engineer's judgement, magnitude of the defect printability/classification problem is greatly reduced due to experience and know-how, still, there is not enough certainty and accuracy until the defect is viewed as it appears on an actual wafer after exposure through the mask. This is especially true in today's lithography steppers using non-standard illumination models such as annular and quadruple. Thus, using currently existing inspection systems, it is nearly impossible to judge a defect's printability without actually printing the mask onto a wafer, which is expensive and time-consuming.
R. A. Budd et al, "A new mask design evaluation tool, the microlithography simulation microscope aerial image measurement system", SPIE, vol. 2197, pages 530-540, 1994, R. A. Budd et al, "Development and application of a new tool for lithographic mask evaluation, the stepper equivalent aerial image measurement system, AIMS", IBM Journal of Research and Development, vol.4, no. ½, 1997 and EP 0 628 806 A disclose a stepper equivalent Aerial Image Measurement System (AIMS). AIMS performs experimental simulations of lithographic conditions using an actual illumination source. AIMS is focused on the printability of discrete locations identified beforehand that are imported in the form of a list of potential defect so that the mask can be moved swiftly from site to site to evaluate the printability of these defects. In some circumstances the measured aerial image is compared to a computer simulated image where the actual illumination parameters of the aerial image are used for the simulated image. The mask illumination source is set up to emulate a specific stepper equivalent condition.
Accordingly, in any mask inspection system, the important decision to be made is whether a given defect will "print" on the underlying photoresist in a lithography process under specified conditions. If a mask defect does not print or have other effects on the lithography process (such as unacceptably narrowing the photolithography process window), then the mask with the defect can still be used to provide acceptable lithography results. Therefore, one can avoid the expense in time and money of repairing and/or replacing masks whose defects do not print. What is desired then, is a method and apparatus for inspecting masks used in the photolithography process that solve the aforementioned problems of currently existing mask inspection systems.
2. A Summary of the Invention
As discussed above, currently known mask inspection systems are not capable of providing an accurate measure of the printability of a potential mask defect and/or overall mask quality assessment without resorting to an actual exposure of a wafer with the mask in question. The present invention affords mask manufacturers and wafer fabricators a method and apparatus for mask inspection in which a simulation of the wafer image of a mask under inspection can be generated.
The present invention is defined by the appended claims. Accordingly, in one embodiment of the present invention, a method of inspecting a mask used in lithography in accordance with claim 1 is provided.
In another embodiment, the method is further characterized by the additional steps of providing a set of photoresist process parameters and generating a second simulated image in response to the set of photoresist process parameters. The second simulated image comprises a simulation of an image which would be printed on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through the portion of the mask, wherein the wafer comprises a coating of photoresist material characterized by the set of photoresist process parameters. In another embodiment, the generation of the first simulated image can be calibrated to take into account a set of photoresist process parameters such that the first simulated image comprises a simulation of an image which would be printed on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through the portion of the mask, wherein the wafer comprises a coating of photoresist material characterized by the set of photoresist process parameters.
In still another embodiment, the method is further characterized by the additional steps of providing a set of etching process parameters and generating a second simulated image in response to the set of etching parameters. The second simulated image comprises a simulation of an image which would be transferred on a wafer if the wafer were etched in accordance with the etching process parameters after the exposure to the illumination source. In another embodiment, the generation of the first simulated image can be calibrated to take into account a set of etching process parameters such that the first simulated image comprises a simulation of an image which would be transferred on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through the portion of the mask and etched in accordance with the set of etching process parameters.
Further, in another embodiment of the present invention, the method is characterized by the additional steps of providing a reference description of the portion of the mask and providing a reference image. The reference image comprises a representation of an image that would be printed on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through a second mask, wherein the second mask is described by the reference description. In one embodiment, the reference description comprises a physical mask which has been determined to be free from defects. In another embodiment, the reference description comprises data in a format such as GDS-II, MEBES, CFLAT, digitized or discretized, and the reference image is a simulated image.
In a further characterization of this embodiment, the method includes comparing the first simulated image with the reference image. Comparing the first simulated image with the reference image may comprise generating a third simulated image which comprises the difference between the first simulated image and the reference image and/or generating a process window related output for each of the images and comparing these process window outputs. Generating the process window related outputs, in one embodiment, includes providing a set of wafer image acceptance criteria, and generating a range of values for at least one optical parameter in the set of optical lithography parameters, for which the images fall either inside or outside the set of wafer image acceptance criteria.
In still another embodiment of the present invention, the method is further characterized by the additional step of analyzing the first simulated image for defects on the first mask. The analyzing step may include the generation of a process window related output, the generation of an analysis output wherein the analysis output comprises a signal which indicates whether the first mask either passed or failed the inspection, and/or the generation of a performance output wherein the performance output comprises data indicating the mask's effect on the performance of an integrated circuit if the mask were to be used in the production of the integrated circuit.
Lastly, the method steps of the above embodiments may in one instance be performed by a computer running a program which implements these steps wherein the program is stored on any appropriate computer storage media such as a hard disk drive or server.
Each of the above embodiments may also be further characterized in an embodiment in which the method of providing the defect area image is further described. For instance, in one embodiment, an inspection tool is used to locate an area on the mask which contains a potential defect. The inspection tool then generates the defect area image and provides the defect area image to the simulator apparatus. In one instance the inspection tool includes a high resolution optical microscope and a CCD camera. The defect area images may be either stored for later inspection, or provided on the fly for immediate analysis.
The present invention, as summarized above with respect to method steps, may be alternatively characterized as an apparatus for inspecting a mask used in optical lithography in accordance with claim 36.
In another embodiment, the apparatus also includes a resource for receiving a set of photoresist process parameters. The image simulator generates a second simulated image in response to these photoresist parameters. The second simulated image comprises a simulation of an image which would be printed on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through the portion of the mask, wherein the wafer comprises a coating of photoresist material characterized by the set of photoresist process parameters.
In still another embodiment, the apparatus includes a resource for receiving a set of etching process parameters. The image simulator generates a second simulated image in response to these etching parameters. The second simulated image comprises a simulation of an image which would be transferred on the wafer if the wafer were etched in accordance with the etching process parameters after the exposure to the illumination source.
In a further instance of the invention, the apparatus includes a resource for receiving a reference description of the portion of the mask and a resource for providing a reference image. The reference image comprises a representation of an image that would be printed on a wafer if the wafer were exposed to an illumination source directed through a second mask, wherein the second mask is described by the reference description. In one embodiment, the reference description comprises a physical mask which has been determined to be free from defects. In another embodiment, the reference description comprises data in a format such as GDS-II, MEBES, CFLAT, digitized or discretized, and the reference image is generated by the image simulator.
In a further characterization of this embodiment, the apparatus includes an image comparator which compares the first simulated image with the reference image. In one instance, the image comparator generates a third simulated image which comprises the difference between the first simulated image and the reference image. In another instance, the image comparator generates first and second process window related outputs. Generating the process window related outputs, in one embodiment, includes providing a set of wafer image acceptance criteria to the image comparator. The image comparator then generates a range of values for at least one optical parameter in the set of optical lithography parameters for which the images fall either inside or outside the set of wafer image acceptance criteria.
In still another embodiment of the present invention, the apparatus includes a defect analyzer which analyzes the first simulated image for defects on the mask. The defect analyzer may generate a process window related output, an analysis output comprising a signal which indicates whether the mask either passed or failed the inspection, and/or a performance output wherein the performance output comprises data indicating the mask's effect on the performance of an integrated circuit if the mask were to be used in the production of the integrated circuit..
Each of the above apparatus embodiments may be further characterized in an embodiment in which an apparatus for providing the defect area image is further described. For instance, the apparatus may include an inspection tool that is used to locate an area on the mask which contains a potential defect. The inspection tool may also generate the defect area image and provide the defect area image to the simulator apparatus. In one instance the inspection tool comprises a high resolution optical microscope and a CCD camera.
Finally, in alternate variations of each of the aforementioned embodiments of the invention, the illumination source may comprise either a visible or non-visible (such as Deep Ultraviolet or DUV) illumination source. Further, the set of optical lithography parameters may comprise data representing the numerical aperture, wavelength, sigma, lens aberration and defocus of an optical lithography system, and the critical dimensions of the mask among other parameters. Still further, the design of the first mask may comprise a bright field, dark field, or phase shifting mask design.
Other aspects and advantages of the present invention can be seen upon review of the figures, the detailed description and the claims which follow.
3. A Brief Description of the Drawings
The figures illustrate the invention by way of example, and not limitation. Like references indicate similar elements.
Figs. 1(a)-(f) illustrate examples of typical photolithography mask defects.
Figs. 2(a)-(b) illustrate an optical proximity corrected photolithography mask with typical defects.
Fig. 3 illustrates, in flowchart form, a typical method used to inspect photolithography masks for defects.
Fig. 4 illustrates, in simplified process flow diagram form, a process of inspecting a photolithography mask for defects in accordance with one embodiment of the present invention.
Figs. 5(a)-(b) illustrate, in simplified process flow diagram form, two embodiments of the image simulation process utilized in the present invention to produce simulated stepper images of an exposed wafer.
Figs. 6(a)-(b) illustrate, in simplified process flow diagram form, two methods of utilizing one embodiment of the present invention to generate image simulations which incorporate photoresist material parameters and etching parameters.
Figs. 7(a)-(b) illustrate simplified mask manufacture and wafer fabrication process flow diagrams showing how an embodiment of the present invention could be integrated into these processes.
Fig. 8 illustrates a system for both on-line and off-line inspection of a mask in accordance with one embodiment of the present invention.
Fig. 9 illustrates a further system for the inspection of a mask in accordance with one embodiment of the present invention.
Figs. 10(a)-(c) illustrate an example of how a potential mask defect can affect the process window of the photolithography process.
Fig. 11 illustrates a process flow chart representing one embodiment of the defect analyzer of Fig. 8.
Fig. 12 illustrates a screen shot of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which a mask with a defect is simulated to print under 5 different sets of stepper conditions.
Fig. 13 illustrates a screen shot depicting the user interface of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention.
Fig. 14 illustrates a screen shot of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which the mask being inspected has been OPC corrected.
Fig. 15 illustrates a further screen shot of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which the mask being inspected has been OPC corrected, in which a process window related output is shown.
Fig. 16 illustrates a situation in which an identified mask defect is shown not to print under a particular set of stepper conditions by a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention.
Fig. 17 illustrates several screenshots of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which a simulated mask image is compared to a simulated design image in order to reveal potential defect areas.
Fig. 18 illustrates a still further screen shot of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which the mask being inspected has been OPC corrected.
Fig. 19 illustrates several screenshots of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which the effect of defects on the process window is demonstrated.
Fig. 20 illustrates a further screen shot of a computer program operating in accordance with one embodiment of the present invention in which a simulated mask image is compared to a simulated design image.
Although many details have been included in the description and the figures, the invention is defined by the scope of the claims. Only limitations found in those claims apply to the invention.
4. the Detailed Description
Photolithography is a process whose input is a mask and whose output is the printed patterns on a wafer. The printed result from a mask is what design engineers, lithographers, and mask manufacturers really care about. Using prior methods, the only way to inspect this printed result was to perform an actual wafer exposure and therefore incur potentially unnecessary costs in time and money. The present invention solves some of the problems of these prior methods by providing for mask inspection that takes printability into account without the need for the expensive steps of actually exposing a wafer. The present invention is capable of using a captured image of a mask -- that accurately enough represents the physical mask (i.e. such as from a high resolution optical microscope or a scanning electron microscope) -- and using that captured image to simulate the wafer exposure that the mask would provide under a given set of stepper conditions. Thus, when an initial mask inspection for defects has been performed and potential defects have been identified, the present invention can be used to simulate the wafer exposure based on captured images of the mask areas surrounding the potential defects. In this way, the printability of potential defects can be directly analyzed without taking the expense of an actual wafer exposure.
Further, the simulation can be controlled to take into account any number of parameters associated with the photolithography process, thereby making the printability determination process specific. Still further, the simulation of each defect can be performed at numerous values of certain process variables that might vary during actual exposure (such as defocus) in order to determine the effect the potential defects have on the wafer manufacturing process window. Subsequent processing can also be modeled with accuracy and with little loss of speed by calibrating the process to take into account photoresist process and etching process parameters.
A detailed description of preferred embodiments is provided with respect to the figures in which Fig. 4 illustrates, in simplified process flow diagram form, a process of inspecting a mask for defects in accordance with one embodiment of the present invention. The process utilizes an inspection tool 400 and a stepper image generator 410. The inspection tool 400 may comprise an image acquiror 430, a defect detection processor 440, and a defect area image generator 442. In one embodiment, the inspection tool 400 may be all inclusive in that it contains each of the aforementioned elements in one package. This all-inclusive tool 400 setup is typically used in on-line mask inspection. In another embodiment, the tool 410 may comprise a number of separately existing elements which interface with each other as is typically used in off-line mask inspection. For example, in one embodiment, the image acquiror 410 is a separate device from the defect detection processor 440.
The image acquiror 430 may comprise a high resolution imaging device such as a high resolution optical microscope, a scanning electron microscope (SEM), a focus ion beam, an atomic force microscope, and a near-field optical microscope such as is well known in the art of mask inspection. The image acquiror 430 scans all or a portion of the mask 420. The image acquiror may also comprise a device such as a CCD camera capable of interfacing with the particular type of microscope used and digitizing the image information from the microscope. For instance, a CCD camera that creates n-bit gray scale image data that is representative of the image from the microscope may be used. The image data may be stored in a format such as Windows BMP on any type of appropriate media including a computer hard disk drive, a CDROM, and a server.
The defect detection processor 440 controls the image acquiror 410. In one embodiment, the defect detection processor 440 provides control signals which control the manner in which the image acquiror 410 scans the mask. Further, the defect detection processor 440 compares the mask images provided by the image acquiror 410 to a set of potential defect criteria and determines what areas of the mask contain potential defects. In one embodiment, the defect detection processor 440 comprises a computer running a program of instructions and interfacing with the image acquiror 430 such that the scanning of the mask is done in the desired manner. In one embodiment, the program operates such that a user may change the parameters of the scanning performed on the mask 420. In another embodiment, the image acquiror 410 could be replaced with a preexisting image of a mask or a portion of a mask. For, any representation of the physical mask 420 that is capable of being analyzed by the defect detection processor 440 is acceptable as an input.
The defect detection processor 440 also controls the defect area image generator 442 which provides images of those areas of the mask 420 which may contain defects. For instance, as the image acquiror 430 provides image input scanned from the mask 420 to the defect detection processor 440, the defect processor 440 determines whether that portion of the mask scanned contains any potential defect areas based on predetermined defect criteria. These criteria may, in one embodiment, be changed by a system user. If a potential defect is discovered, the defect processor 440 signals the defect area image generator to provide a defect area image of the area surrounding the potential defect. The defect area image generator 442 thus provides defect area image data 444. In one embodiment, the defect area image generator 442 may be a part of the image acquiror 430, for instance, the defect area image generator 442 may comprise the CCD camera of the image acquiror 430. In another embodiment, the defect area image generator 442 may be a separate device which receives image input from the image acquiror 430.
The embodiments of the inspection tool 400 may be utilized to provide data for the stepper image generator 410 in a number of ways. First, the image acquiror 430 could scan the entire mask 420 or a portion of the mask 420 without any control from the defect detection processor 440 and store the resulting image data in a storage device 447 such as a server after digitizing the data with a digitizing device 446 such as an image grabber. This same image data could also be provided directly to the stepper image generator 410 via a real time data feed. Second, in the case of the image acquiror 430 being under the control of the defect detection processor 440, the defect area image generator 442 may provide the defect area image data 444 either directly to the image generator 410 via a real time data feed (on-line inspection) or provide the image data 444 to the digitizing device 446 and then to the storage device 447 for later off-line inspection.
The stepper image generator 410 comprises an input device 450 and an image simulator 460. The input device 450, in the case of stored image data from the storage device 447, may comprise any hardware suitable for reading the type of media upon which the image data is stored, including a computer hard disk drive, a CDROM reader, and a personal computer attached to a server via a network, among others. In the case of a real time feed of image data from the defect area image generator 442 or image acquiror 430, the input device may comprise a digitizing device such as an image grabber. For instance, in one embodiment the input device may comprise an 8-bit frame grabber device such as those that are known in the art including the Matrox™ Meteor™ and Pulsar™. The input device 450 also receives other input data such as lithography conditions input 445. In one embodiment, the image simulator 460 comprises a computer implemented program which accepts the stored image data or real time feed from the input device 450, and produces a simulation of the stepper image 470 on a wafer for the physical mask 420. In this computer implemented embodiment, the image simulator 460 program may be run on a variety of computer platforms including: a PC using the Windows 95™ or NT™ 4.0 operating system with 128 MB of RAM and a 200 MHz Pentium Pro™ microprocessor, either stand alone or connected to a network, and a SUN™ workstation computer among others. In some cases, the amount of time required for one embodiment of the image simulator 460 to simulate an image of conventional CCD array size is less than a second.
In one embodiment, the inspection tool 400 and stepper image generator 410 operate to produce a simulated stepper image 470, a simulated process window 480 output for a physical mask 420, and/or other performance related output used to characterize, define, or measure the effect of a defect(s) on integrated circuit performance as follows. The physical mask 420 is first inspected by the inspection tool 400. The inspection tool 400 scans the physical mask 420 for possible defects and the defect area image generator 442, pursuant to direction from the defect detection processor 440, generates defect area images 432 of those areas of the mask containing possible defects. The defect area image data 444 is then either fed to the input device 450 in real time, and/or stored in the storage device 447 via the digitizing device 446 for later inspection.
The input device 450 receives the defect area image data 444 from the defect area image generator 442 or the storage device 447. The defect area image data 444 is then output to the image simulator 460. The image simulator 460 receives lithography conditions input 445. The lithography conditions input 445 contains data that is specific to the lithography conditions and system parameters under which the physical mask is to be later exposed if it passes inspection. This data may include parameters such as the numerical aperture of the system (NA), the coherency value of the system (σ), the wavelength of the illumination being used in the system (λ), the defocus of the exposure, lens aberrations, substrate conditions and the critical dimensions of the design among others. Further, the lithography conditions input 445 may contain a range of these parameters such that the simulation can be performed a number of times for different combinations of these parameters. In this manner, the printability of a mask defect can be analyzed over a range of possible lithography conditions, and the effect of a potential mask defect on the process window can also be analyzed.
In one embodiment, the image simulator 460 receives the defect area image data 444 from the input device 450 and the lithography conditions input 445, and generates a simulated stepper image 470 which is a simulation of the wafer exposure which the defect area of the physical mask 420 would generate if an optical lithography exposure had been performed under the same conditions as the lithography conditions input 445. Similarly, the image simulator 460 can generate a simulated process window 480 which represents the effect the potential defect area has on the process window, and/or a performance output 482 as discussed above. Furthermore, in one embodiment, the image simulator 460 is able to generate a simulated stepper image 470 for a potential defect area of a mask of a number of different types of mask design including bright field, dark field, and attenuated phase-shifting mask designs. The simulated stepper image 470, the simulated process window 480, and/or the performance output 482 may then be inspected to determine the printability of any identified potential defect area without actually taking the expense of exposing a real wafer with the mask, as will be explained in more detail with respect to Figs. 8-11. Finally, in other embodiments, the image simulator 460 could take into account the parameters associated with the photoresist material to be used and/or the etching process to be used on the exposed wafer in order to simulate the end result of these processes as shown by block 484 and discussed more fully below with respect to Fig. 6.
Figs. 5(a)-(b) illustrate in process flow diagram form, two embodiments of the image simulation process utilized in the present invention to produce simulated stepper images of an exposed wafer. Fig. 5(a) illustrates an embodiment of the process as it would be used on a design mask such as by the design image simulator 960 to be described below with respect to Fig. 9. Fig. 5(b) illustrates an embodiment of the process as it would be used on a captured image of a physical mask such as by the image simulator 460 of Fig. 4, the image simulators 830 and 860 of Fig. 8, and the mask image simulator 950 and design image simulator 960 of Fig. 9. Prior to discussing the specifics of Figs.5(a)-(b) however, it would be beneficial to lay some of the background behind the simulation processes illustrated therein.
In overview, the simulation process as described with respect to Figs.5(a)-(b) makes use of what is referred to in the art as the Hopkins model in order to approximate the process of optical lithography. According to the Hopkins model, in a sufficiently general setting, the process of partially coherent optical imaging (which is the exclusive process currently employed in optical lithography) may be described by the following nonlinear integral equation:
where,
I(•) = the intensity image at the image plane;
g(•) = amplitude image at the image plane;
f(•) = object being imaged (mask);
K(•) = coherent point spread function -- describes properties of lithography system;
J0(•) = mutual intensity function -- describes coherence properties of the illumination.
However, the above nonlinear integral equation is far too complex to be applied efficiently to realistic integrated circuit patterns. Thus, the image simulations to be discussed with respect to Figs. 5(a)-(b) are, in one embodiment, produced using a process that is a simplified approximation of the Hopkins model as applied specifically to integrated circuits. In this process, the Hopkins model is first effectively broken down into a number of low pass filters that are applied to the input data. The resulting images are then added to generate the simulated image.
The basic premise of this Hopkins model approximation is contained in Y. C. Pati et al., "Phase -shifting masks for microlithography: automated design and mask requirements", JOURNAL OF THE OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, Vol. 11, No. 9, pp. 2438-52, (Sep. 1994), which is incorporated herein by reference as if set forth fully, and in Y.C. Pati et al., "Exploiting Structure in Fast Aerial Image Computation for Integrated Circuit Patterns", IEEE TRANSACTIONS ON SEMICONDUCTOR CIRCUIT MANUFACTURING, Vol. 10, No. 1, pp. 62-74, (Feb. 1997) (hereinafter Pati et al.), which is also incorporated by reference herein as if set forth fully.
The method referenced above is known as "Optimal Coherent Approximation's" (OCA's) or "Optimal Coherent Decompositions" (OCD's). This method makes use of a structure that can be extracted from the partially coherent Hopkins model in order to simplify the equation on a first order. The first order simplification obtained through OCA utilizes the fact that in the special case where illumination is completely coherent, the Hopkins model simplifies to:
where "*" denotes the 2-D convolution operator,
Thus, in the coherent case the computation required to compute the image reduces to O(N log2 N) using the Fast Fourier transform (FFT), where N is the number of discrete sample points considered. This fact, combined with the utilization of an integrated circuit's inherent structure to drastically reduce the number of computations
Traduzione - Italiano Titolo: METODO E SISTEMA PER L’ISPEZIONE DI UNA MASCHERA LITOGRAFICA
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Descrizione
1. Sfondo dell’invenzione
a. Campo dell’invenzione
Questa invenzione si riferisce al campo della fabbricazione dei circuiti integrati. In particolare, l’invenzione si riferisce a un sistema per l’ispezione dei difetti sulle maschere utilizzate nella fabbricazione dei circuiti integrati.
b. Descrizione della tecnica correlata
Nel progettare un circuito integrato (integrated circuit, IC), gli ingegneri tipicamente si basano sugli strumenti della simulazione al computer per contribuire a creare un progetto schematico del circuito composto da singoli dispositivi accoppiati insieme per realizzare una certa funzione. Per fabbricare effettivamente questo circuito in un substrato semiconduttore il circuito deve essere tradotto in una rappresentazione fisica, o uno schema, che può essere trasferito esso stesso su un modello (vale a dire, la maschera), e in seguito sulla superficie di silicio. Inoltre, gli strumenti di progettazione assistita dal computer (computer aided design, CAD) aiutano i progettisti dello schema nel compito di tradurre gli elementi discreti del circuito nelle forme che incorporeranno i dispositivi stessi nel IC completo. Queste forme costituiscono i singoli componenti del circuito, come gli elettrodi di porta, le regioni di ossidazione di campo, le regioni di diffusione, le interconnessioni metalliche, e così via.
Una volta che lo schema del circuito è stato creato, la fase successiva per fabbricare il circuito integrato (IC) è di trasferire lo schema su un substrato semiconduttore. Un modo per fare ciò è di utilizzare il processo della litografia ottica in cui lo schema è innanzitutto trasferito su un modello fisico che a sua volta è utilizzato per proiettare otticamente lo schema su un wafer al silicio.
Nel trasferire lo schema a un modello fisico, generalmente viene creata una maschera (generalmente una piastra di quarzo rivestita di cromo) per ciascuno strato del progetto del circuito integrato. Questo è fatto inviando in ingresso i dati che rappresentano il progetto dello schema per quello strato in un dispositivo come una apparecchiatura per grafia diretta mediante pennello elettronico che scrive il modello dello schema del circuito integrato nel materiale della maschera. Nei circuiti integrati meno complicati e densi, ciascuna maschera comprende le forme geometriche che rappresentano il modello di circuito desiderato per il suo strato corrispondente. Nei circuiti più complicati e densi nei quali la dimensione delle fattezze del circuito approccia i limiti ottici del processo litografico, le maschere possono comprendere anche le fattezze di correzione di prossimità ottica come le terminazioni, le teste di martello, le barre di correzione e di supporto che sono le fattezze delle dimensioni sublitografiche progettate per compensare gli effetti di prossimità. In altri progetti di circuiti avanzati, le maschere a spostamento di fase possono essere utilizzate per aggirare determinate limitazioni ottiche di base del processo aumentando il contrasto del processo di litografia ottica.
Successivamente queste maschere sono utilizzate per proiettare otticamente lo schema su un wafer al silicio rivestito con un materiale fotosensibile (fotoresist). Per ciascuno strato del progetto, una luce corrispondente a quello strato è puntata sulla maschera attraverso una sorgente di luce visibile o una sorgente di luce ultra – violetta. Questa luce passa attraverso le regioni trasparenti della maschera, la cui immagine espone lo strato fotosensibile sottostante, ed è bloccata dalle regioni opache della maschera, lasciando quella porzione sottostante dello strato fotosensibile non esposta. Successivamente lo strato fotosensibile esposto è sviluppato, tipicamente attraverso la rimozione chimica delle regioni esposte/non esposte dello strato fotosensibile. Il risultato finale è un wafer di semiconduttore rivestito con uno strato fotosensibile che esibisce un modello desiderato che definisce le geometrie, le fattezze, le linee e le forme di quello strato. Successivamente questo processo viene ripetuto per ciascuno strato del progetto.
Man mano che i progetti di circuito integrato diventano più complicati, diventa sempre più importante che le maschere utilizzate nella fotolitografia siano rappresentazioni accurate dello schema del progetto originale. Sfortunatamente, è irrealistico ipotizzare che l’apparecchiatura per grafia diretta mediante pennello elettronico e le altre macchine utilizzate per fabbricare queste maschere possano farlo senza errore. Nel processo di fabbricazione tipico, alcuni difetti della maschera si verificano al di fuori del processo controllato.
Un difetto su una maschera è qualsiasi cosa che sia differente dalla banca dati del progetto e che sia ritenuta intollerabile da uno strumento di ispezione o da un ingegnere di ispezione. Le Fig. 1(a) - (f), illustrano una maschera 100 che rappresenta un progetto semplice di circuito integrato che contiene alcuni dei difetti comuni della maschera che si verificano durante il processo di fabbricazione della maschera. La maschera 100 comprende un’area opaca 105, tipicamente fatta di cromo, e aree trasparenti 110 e 120 che rappresentano le primitive della geometria da trasferire sullo strato fotosensibile , e tipicamente fatte di quarzo. La Fig. 1(a) illustra un difetto isolato di un foro per perno 125 nell’area opaca 105 della maschera 100. La Fig. 1(b) illustra un difetto isolato di un punto opaco 130 nell’area trasparente 110 della maschera 100. La Fig. 1(c) illustra difetti di intrusione del bordo 140 nelle aree trasparenti 110 e 120 della maschera 100. La Fig. 1(d) illustra difetti di sporgenza del bordo 145 nell’area opaca 105 della maschera 100. La Fig. 1(e) illustra un difetto di rottura della geometria 150 nell’area trasparente 110 della maschera 100. In fine, la Fig. 1(f) illustra un difetto di ponte della geometria 155 nell’area opaca 105 della maschera 100.
Le Fig. 2(a) – (b) illustrano i possibili difetti che possono verificarsi su una maschera che utilizzi le fattezze di correzione della prossimità ottica. La fig. 2(a) illustra un singolo progetto desiderato di maschera 200 che consiste in un’area opaca 205, un’area trasparente 210 che rappresenta la forma desiderata che deve essere trasferita al materiale fotosensibile, e le terminazioni del progetto 215 che sono aggiunte al progetto per correggere gli effetti della prossimità ottica. La Fig. 2(b) illustra la maschera 220 che potrebbe essere fabbricata da una apparecchiatura convenzionale per grafia diretta mediante pennello elettronico quando il progetto di maschera 200 sia utilizzato come dato in ingresso. La maschera 220 comprende un’area opaca 225, un’area trasparente 230, e terminazioni modificate 235. Si noti che la forma delle terminazioni modificate 235 è differente dalla forma delle terminazioni del progetto 215. Questo avviene poiché la dimensione delle terminazioni è molto piccola – sono progettate per essere inferiori alla risoluzione ottica del processo litografico da utilizzare – e il pennello elettronico tipicamente non può riprodurre perfettamente la forma della terminazione del progetto 215 sul materiale della maschera. Il risultato sarebbe simile per le maschere che utilizzano altre fattezze di correzione di prossimità ottica come le teste di martello, le barre di correzione e le barre di supporto.
Un metodo tipico per ispezionare una maschera alla ricerca di difetti come quelli illustrati nelle Fig. 1 e 2 è illustrato nel diagramma di flusso della Fig.3. Dopo aver progettato un circuito integrato 300 e aver creato un file di dati o i dati del progetto della maschera 310, i dati del progetto della maschera sono forniti a un dispositivo come una apparecchiatura per la grafia diretta mediante pennello elettronico o un’apparecchiatura per la scrittura laser e viene fabbricata maschera 315. Successivamente la maschera è ispezionata alla ricerca di difetti come illustrato nel blocco 320 del processo. L’ispezione può essere eseguita, per esempio, facendo una scansione della superficie della maschera con un microscopio ad alta risoluzione (per esempio, ottico, a scansione elettronica, a fascio ionico focalizzato, a forza atomica, e microscopi ottici in campo prossimo) e catturando le immagini della maschera. Queste immagini della maschera possono essere successivamente osservate dagli ingegneri fuori linea o dai lavoratori addetti alla fabbricazione della maschera in linea per identificare i difetti sulla maschera fisica. La fase successiva, illustrata come il blocco di decisione 325, consiste nel determinare se la maschera ispezionata è sufficientemente buona oppure no per l’utilizzo nel processo litografico. Questa fase può essere eseguita fuori linea da un ingegnere di ispezione esperto, o dai lavoratori addetti alla fabbricazione in linea possibilmente con l’aiuto di un software di ispezione. Se non vi sono difetti, o se i difetti sono scoperti ma ritenuti essere entro i limiti di tolleranza definiti dal fabbricante o dall’utente finale, allora la maschera è fatta passare e utilizzata per esporre un wafer come illustrato nel blocco 340 del processo. Se vengono scoperti dei difetti che ricadono al di fuori dei limiti di tolleranza, allora la maschera non supera l’ispezione 325, e deve essere presa una decisione 330 relativamente alla possibilità che la maschera possa essere ripulita e/o riparata per correggere i difetti 335, o alla possibilità che i difetti siano talmente gravi che debba essere fabbricata una nuova maschera 315. Questo processo è ripetuto finché una maschera fabbricata supera l’ispezione 325.
Una volta che viene fabbricata una maschera fisica che supera l’ispezione, è importante ispezionare ulteriormente la maschera per assicurarsi che la maschera produrrà l’immagine desiderata su un materiale fotosensibile dopo che un wafer è esposto alla luce attraverso la maschera. Questo è realizzato tipicamente intraprendendo la fase costosa di esporre effettivamente e di processare un wafer utilizzando la maschera che viene ispezionata come illustrato al blocco 340 del processo. Il wafer processato è successivamente ispezionato al blocco 345, e viene presa una decisione 350 per determinare se vi sia qualche difetto e se i difetti ricadano entro i limiti di tolleranza. Se i difetti scoperti sono sostanziali, allora, come prima, viene stabilito 330 se i difetti possano essere riparati 335 o se debba essere fabbricata una nuova maschera 315. Questo processo è ripetuto finché viene fabbricata una maschera che produrrà i modelli di wafer desiderati e che supererà l’ispezione al livello di wafer illustrata nel blocco 350. Questa maschera viene in seguito utilizzata nel processo litografico per esporre lo strato corrispondente nel processo di fabbricazione complessivo.
Tuttavia, non tutti i difetti della maschera sono importanti relativamente al risultato finale desiderato – il risultato finale essendo una rappresentazione accurata dello schema del progetto originale sul materiale fotosensibile o inciso nel silicio. Questo avviene perché non tutti i difetti della maschera “stamperanno”. Parlando in modo discorsivo, la stampabilità di un difetto è il modo in cui un difetto avrebbe conseguenze sul risultato di un dato processo di litografia e/o incisione. L’importanza della stampabilità diventa ora evidente, in quanto lo scopo dell’ispezione alla ricerca di un difetto è di identificare in modo corretto un difetto al fine di evitare una lavorazione errata del wafer. Poiché la stampabilità di un difetto è associata principalmente all’esposizione del fotoripetitore, essa dipende dalle condizioni particolari di esposizione del fotoripetitore. Ne consegue che dire che un difetto è “non stampabile” significa che esso ha un effetto piccolo sul risultato aspettato di una particolare esposizione del fotoripetitore, sebbene esso possa diventare “stampabile” con un insieme differente di condizioni di esposizione del fotoripetitore. Messa in un modo differente, la stampabilità è altamente dipendente dalle condizioni del fotoripetitore, poiché un difetto può stampare in un insieme di condizioni, ma non in un altro. Queste condizioni includono: la dimensione del difetto, la lunghezza d’onda, l’apertura numerica, il fattore di coerenza, la modalità di illuminazione, il tempo di esposizione, la focalizzazione / defocalizzazione dell’esposizione, e le caratteristiche di riflessione/trasmissione del difetto tra l’altro.
Attualmente, gli strumenti per l’ispezione che sono in uso includono strumenti che ispezionano le maschere sia in linea (vale a dire nella linea di produzione) sia fuori linea. Gli strumenti di ispezione in linea convenzionali tipicamente eseguono una scansione dell’intera area della maschera alla ricerca delle aree di difetto, e alcuni possono anche confrontare il risultato ispezionato con la banca dati dello schema della maschera quando vengono rilevati i difetti. Tuttavia, le analisi del difetto degli strumenti tipici di ispezione in linea si basano principalmente (o solamente) sulla dimensione del difetto rilevato dalle ottiche per definire la gravità di un particolare difetto. Mentre nel passato questo schema è stato in qualche modo di successo, le maschere attuali sono progettate con fattezze sempre più piccole, utilizzando metodi avanzati e non convenzionali come la OPC. A causa di questi cambiamenti, i metodi convenzionali di ispezione stanno rapidamente dimostrando di essere inadeguati in quanto non affrontano svariate questioni.
Innanzitutto, se un difetto stampi oppure no dipende molto sia dalla sua posizione sia dalla dimensione, non soltanto dalla dimensione o dalle sole caratteristiche di trasmissione/riflessione. Per esempio, un cospicuo punto difettoso in un’area isolata può avere un effetto piccolo o nullo sullo strato corrente e sui successivi strati del processo. D’altra parte, un punto piccolo vicino a un angolo o a un bordo, o a un’area critica non dovrebbe essere rigettato senza un esame più da vicino. Questo è vero sia per le maschere binarie convenzionali sia per le maschere avanzate. In secondo luogo, le fattezze avanzate della maschera OPC possono attivare rilevazioni di difetto false. Lo schema convenzionale tipico può riportare in modo falsato una fattezza OPC o una fattezza OPC imperfetta (per esempio, terminazioni arrotondate come illustrato nella Fig. 2) come un difetto, quando essa ha effettivamente un impatto piccolo sul risultato finale. Sebbene alcuni strumenti esistenti di ispezione della maschera abbiano una impostazione di scala mobile per “tollerare” le fattezze OPC, questo non è un metodo robusto in quanto i difetti associati a queste fattezze che speciali possono essere trascurati a causa di questa scala arbitraria. Inoltre, le fattezze OPC sono progettate tipicamente per un insieme specifico di parametri del fotoripetitore, ma le scale mobili degli strumenti convenzionali sono cieche a questi parametri ottici.
In terzo luogo, le informazioni sulla fase non sono prese in considerazione in modo appropriato, se non affatto, nello schema convenzionale tipico di ispezione del difetto. Ne consegue che, le maschere a spostamento di fase non sono ispezionate in modo appropriato. In fine, sebbene un difetto possa non sembrare che stampi, potrebbe avere effetti sulla latitudine del processo in un modo che diminuirà la resa e non sarà rilevato dai sistemi convenzionali di ispezione del difetto in linea.
D’altra parte, anche le stazioni di ispezione fuori linea, che eseguano direttamente una scansione alla ricerca di difetti o che passino in rassegna i dati del difetto precedentemente memorizzati non determinabili da uno strumento in linea, affrontano le stesse questioni. Inoltre, queste questioni possono richiedere il tempo di ingegneri costosi per essere risolte, e pertanto riducono la potenzialità produttiva alzando contemporaneamente i costi. Sebbene con il giudizio di un ingegnere, la grandezza del problema della stampabilità/classificazione di un difetto sia notevolmente ridotta grazie all’esperienza e alla conoscenza, tuttavia, non vi sono ancora una certezza e un’accuratezza sufficienti finché non possibile vedere come il difetto appare su un wafer reale dopo l’esposizione attraverso la maschera. Questo è vero specialmente nei fotoripetitori litografici odierni che utilizzano dei modelli di illuminazione non – standard come l’anulare e il quadruplo. Pertanto, utilizzando i sistemi di ispezione attualmente esistenti, è quasi impossibile giudicare la stampabilità di un difetto senza effettivamente stampare la maschera su un wafer, il che è costoso e porta via molto tempo.
R.A. Budd et al, in “A new mask design evaluation tool, the microlithography simulation microscope aerial image measurement system”, SPIE, volume 2197, pagine 530 - 540, 1994, R.A. Budd et al, in “Development and application of a new tool for lithographic mask evaluation, the stepper equivalent aerial image measurement system, AIMS”, IBM Journal of Research and Development, volume 4, numero ½, 1997 e il documento EP 0 628 806 A illustrano un Sistema di Misura dell’Immagine Aerea (Aerial Image Measurement System, AIMS) equivalente del fotoriproduttore. Il AIMS effettua le simulazioni sperimentali delle condizioni litografiche utilizzando una sorgente reale di illuminazione. Il AIMS è focalizzato sulla stampabilità delle posizioni discrete identificate in anticipo che sono importate nella forma di una lista di potenziali difetti in modo tale che la maschera possa essere spostata rapidamente da sito a sito per valutare la stampabilità di questi difetti. In alcune circostanze l’immagine aerea misurata è confrontata con un’immagine simulata al computer in cui i parametri dell’illuminazione reale dell’immagine aerea sono utilizzati per l’immagine simulata. La sorgente di illuminazione della maschera è impostata per emulare una condizione particolare equivalente del fotoripetitore.
Di conseguenza, in qualsiasi sistema di ispezione della maschera, la decisione importante da prendere è se un dato difetto “si stamperà” sul materiale fotosensibile sottostante in un processo litografico in particolari condizioni. Se un difetto della maschera non si stampa oppure ha altri effetti sul processo litografico (come il restringimento in modo inaccettabile della finestra del processo fotolitografico), allora la maschera con il difetto può ancora essere utilizzata per fornire risultati litografici accettabili. Ne consegue che, è possibile evitare la spesa in termini di tempo e di denaro per riparare e/o sostituire le maschere i cui difetti non si stampano. Di conseguenza ciò che si desidera, è un metodo e una apparecchiatura per ispezionare le maschere utilizzate nel processo fotolitografico che risolvano i problemi precedentemente menzionati dei sistemi di ispezione della maschera attualmente esistenti.
2. Riepilogo dell’invenzione
Come discusso sopra, i sistemi di ispezione della maschera attualmente noti non sono in grado di fornire una misura accurata della stampabilità di un potenziale difetto della maschera e/o una stima complessiva della qualità della maschera senza ricorrere a un’esposizione effettiva di un wafer con la maschera in questione. La presente invenzione fornisce ai fabbricanti della maschera e ai produttori dei wafer un metodo e una apparecchiatura per l’ispezione della maschera in cui è possibile generare una simulazione dell’immagine del wafer di una maschera sotto ispezione.
La presente invenzione è definita dalle rivendicazioni allegate. Di conseguenza, in una forma di realizzazione della presente invenzione, è fornito un metodo per ispezionare una maschera utilizzata in litografia secondo la rivendicazione 1.
In un’altra forma di realizzazione, il metodo è caratterizzato ulteriormente dalle fasi aggiuntive di fornire un insieme di parametri del processo fotosensibile e di generare una seconda immagine simulata in risposta all’insieme di parametri del processo fotosensibile. La seconda immagine simulata comprende una simulazione di un’immagine che sarebbe stampata su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso la porzione della maschera, in cui il wafer comprende un rivestimento di materiale fotosensibile caratterizzato dall’insieme di parametri del processo fotosensibile. In un’altra forma di realizzazione, la generazione della prima immagine simulata può essere calibrata per tenere in considerazione un insieme di parametri del processo fotosensibile così che la prima immagine simulata comprende una simulazione di un’immagine che sarebbe stampata su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso la porzione della maschera, in cui il wafer comprende un rivestimento di materiale fotosensibile caratterizzato dall’insieme di parametri del processo fotosensibile.
In ancora un’altra forma di realizzazione, il metodo è caratterizzato ulteriormente dalle fasi aggiuntive di fornire un insieme di parametri del processo di incisione e di generare una seconda immagine simulata in risposta all’insieme dei parametri dell’incisione. La seconda immagine simulata comprende una simulazione di un’immagine che sarebbe trasferita su un wafer se il wafer fosse inciso in accordo con i parametri del processo di incisione dopo l’esposizione alla sorgente di illuminazione. In un’altra forma di realizzazione, la generazione della prima immagine simulata può essere calibrata per tenere in considerazione un insieme di parametri del processo di incisione in modo tale che la prima immagine simulata comprenda una simulazione di un’immagine che sarebbe trasferita su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso la porzione della maschera e fosse inciso secondo l’insieme dei parametri del processo di incisione.
Inoltre, in un’altra forma di realizzazione della presente invenzione, il metodo è caratterizzato dalle fasi aggiuntive di fornire una descrizione di riferimento della porzione della maschera e di fornire un’immagine di riferimento. L’immagine di riferimento comprende una rappresentazione di un’immagine che sarebbe stampata su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso una seconda maschera, in cui la seconda maschera è descritta tramite la descrizione di riferimento. In una forma di realizzazione, la descrizione di riferimento comprende una maschera fisica che è stata giudicata essere priva di difetti. In un’altra forma di realizzazione, la descrizione di riferimento comprende i dati in un formato come GDS-II, MEBES, CFLAT, digitalizzato o discretizzato, e l’immagine di riferimento è un’immagine simulata.
In una ulteriore caratterizzazione di questa forma di realizzazione, il metodo include confrontare la prima immagine simulata con l’immagine di riferimento. Confrontare la prima immagine simulata con l’immagine di riferimento può comprendere generare una terza immagine simulata che comprende la differenza tra la prima immagine simulata e l’immagine di riferimento e/o generare un dato in uscita correlato alla finestra del processo per ciascuna delle immagini e confrontare questi dati in uscita della finestra del processo. Generare i dati in uscita correlati con la finestra del processo, in una forma di realizzazione, include fornire un insieme di criteri di accettazione dell’immagine del wafer, e generare una gamma di valori per almeno un parametro ottico nell’insieme dei parametri ottici litografici, per i quali le immagini ricadono all’interno o all’esterno dell’insieme dei criteri di accettazione dell’immagine del wafer.
In ancora un’altra forma di realizzazione della presente invenzione, il metodo è inoltre caratterizzato dalla fase aggiuntiva di analizzare la prima immagine simulata alla ricerca di difetti nella prima maschera. La fase di analisi può includere la generazione di un dato in uscita correlato alla finestra del processo, la generazione di un dato in uscita dell’analisi in cui il dato in uscita dell’analisi comprende un segnale che indica se la prima maschera ha superato o non ha superato l’ispezione, e/o la generazione di un esito della prestazione in cui l’esito della prestazione comprende i dati che indicano l’effetto della maschera sulla prestazione di un circuito integrato se la maschera dovesse essere utilizzata nella fabbricazione del circuito integrato.
Infine, le fasi del metodo delle forme di realizzazione di cui sopra possono essere eseguite in un esempio da un computer che esegue un programma che implementa queste fasi in cui il programma è memorizzato su qualsiasi supporto di memorizzazione di computer appropriato come un disco rigido o un server.
Ciascuna delle forme di realizzazione di cui sopra può anche essere caratterizzata ulteriormente in una forma di realizzazione in cui è descritto inoltre il metodo di fornire l’immagine dell’area del difetto. Per esempio, in una forma di realizzazione, uno strumento di ispezione è utilizzato per individuare un’area sulla maschera che contiene un potenziale difetto. Successivamente lo strumento di ispezione genera l’immagine dell’area del difetto e fornisce l’immagine dell’area del difetto all’apparecchiatura del simulatore. In un esempio lo strumento di ispezione include un microscopio ottico ad alta risoluzione e una videocamera CCD. Le immagini dell’area del difetto possono essere memorizzate per una ispezione successiva, o possono essere fornite al volo per l’analisi immediata.
La presente invenzione, come riepilogato sopra relativamente alle fasi del metodo, può essere caratterizzata alternativamente come un’apparecchiatura per ispezionare una maschera utilizzata nella litografia ottica secondo la rivendicazione 36.
In un’altra forma di realizzazione, l’apparecchiatura include anche una risorsa per ricevere un insieme di parametri del processo fotosensibile. Il simulatore dell’immagine genera una seconda immagine simulata in risposta a questi parametri del materiale fotosensibile. La seconda immagine simulata comprende una simulazione di un’immagine che sarebbe stampata su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso la porzione della maschera, in cui il wafer comprende un rivestimento di materiale fotosensibile caratterizzato dall’insieme dei parametri del processo fotosensibile.
In ancora un’altra forma di realizzazione, l’apparecchiatura include una risorsa per ricevere un insieme di parametri dei processi di incisione. Il simulatore dell’immagine genera una seconda immagine simulata in risposta a questi parametri di incisione. La seconda immagine simulata comprende una simulazione di un’immagine che sarebbe trasferita al wafer se il wafer fosse inciso in accordo con i parametri del processo di incisione dopo l’esposizione alla sorgente di illuminazione.
In un ulteriore esempio dell’invenzione, l’apparecchiatura include una risorsa per ricevere una descrizione di riferimento della porzione della maschera e una risorsa per fornire un’immagine di riferimento. L’immagine di riferimento comprende una rappresentazione di un’immagine che sarebbe stampata su un wafer se il wafer fosse esposto a una sorgente di illuminazione diretta attraverso una seconda maschera, in cui la seconda maschera è descritta dalla descrizione di riferimento. In una forma di realizzazione, la descrizione di riferimento comprende una maschera fisica che è stata giudicata priva di difetti. In un’altra forma di realizzazione, la descrizione di riferimento comprende i dati in un formato come GDS-II, MEBES, CFLAT, digitalizzati o discretizzati, e l’immagine di riferimento è generata dal simulatore dell’immagine.
In un’ulteriore caratterizzazione di questa forma di realizzazione, l’apparecchiatura include un comparatore di immagini che confronta la prima immagine simulata con l’immagine di riferimento. In un esempio, il comparatore di immagini genera una terza immagine simulata che comprende la differenza tra la prima immagine simulata e l’immagine di riferimento. In un altro esempio, il comparatore di immagini genera primi e secondi dati in uscita correlati con la finestra del processo. Generare i dati in uscita correlati con la finestra del processo, in una forma di realizzazione, include fornire un insieme di criteri di accettazione dell’immagine del wafer al comparatore di immagini. Successivamente il comparatore di immagini genera una gamma di valori per almeno un parametro ottico nell’insieme dei parametri ottici litografici per cui l’immagine ricade all’interno o all’esterno dell’insieme dei criteri di accettazione dell’immagine del wafer.
In ancora un’altra forma di realizzazione della presente invenzione, l’apparecchiatura include un analizzatore di difetti che analizza la prima immagine simulata alla ricerca di difetti sulla maschera. L’analizzatore di difetti può generare un dato in uscita correlato con la finestra del processo, un dato in uscita dell’analisi comprendente un segnale che indica se la maschera ha superato o non ha superato l’ispezione, e/o un esito della prestazione in cui l’esito della prestazione comprende i dati che indicano l’effetto della maschera sulla prestazione di un circuito integrato se la maschera dovesse essere utilizzata nella fabbricazione del circuito integrato.
Ciascuna delle forme di realizzazione dell’apparecchiatura di cui sopra può essere ulteriormente caratterizzata in una forma di realizzazione in cui è descritta inoltre una apparecchiatura per fornire l’immagine dell’area del difetto. Per esempio, l’apparecchiatura può includere uno strumento di ispezione che è utilizzato per localizzare un’area sulla maschera che contenga un potenziale difetto. Lo strumento di ispezione può anche generare l’immagine dell’area del difetto e fornire l’immagine dell’area del difetto all’apparecchiatura del simulatore. In un esempio lo strumento di ispezione comprende un microscopio ottico ad alta risoluzione e una videocamera CCD.
Infine, nelle varianti alternative di ciascuna delle forme di realizzazione summenzionate dell’invenzione, la sorgente di illuminazione può comprendere una sorgente di illuminazione visibile o non visibile (come l’Ultravioletto Profondo o DUV). Inoltre, l’insieme dei parametri litografici ottici può comprendere i dati che rappresentano l’apertura numerica, la lunghezza d’onda, la sigma, l’aberrazione della lente e la defocalizzazione di un sistema litografico ottico, e le dimensioni critiche della maschera tra gli altri parametri. Ancora di più, il progetto della prima maschera può comprendere un campo chiaro, un campo oscuro, o un progetto di maschera a spostamento di fase.
Altri aspetti e vantaggi della presente invenzione possono essere osservati in seguito alla rassegna delle figure, della descrizione dettagliata e delle rivendicazioni che seguono.
3. Breve descrizione dei Disegni
Le figure illustrano l’invenzione a titolo di esempio, e non di limitazione. Numeri di riferimento analoghi indicano elementi simili.
Le Fig. 1(a) – (f) illustrano esempi dei tipici difetti della maschera litografica.
Le Fig. 2(a) – (b) illustrano una maschera fotolitografica corretta in prossimità ottica con difetti tipici.
La Fig. 3 illustra, nella forma di un diagramma di flusso, un metodo tipico utilizzato per ispezionare le maschere fotolitografiche alla ricerca di difetti.
La Fig. 4 illustra, nella forma semplificata di un diagramma di flusso del processo, un processo per ispezionare una maschera fotolitografica alla ricerca di difetti in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione.
Le Fig. 5(a) – (b) illustrano, nella forma semplificata di un diagramma di flusso del processo, due forme di realizzazione del processo di simulazione dell’immagine utilizzato nella presente invenzione per produrre le immagini simulate del fotoripetitore di un wafer esposto.
Le Fig. 6(a) – (b) illustrano, nella forma semplificata di un diagramma di flusso del processo, due metodi per utilizzare una forma di realizzazione della presente invenzione per generare le simulazioni dell’immagine che incorporano i parametri del materiale fotosensibile e i parametri dell’incisione.
Le Fig. 7(a) – (b) illustrano i diagrammi di flusso semplificati della fabbricazione della maschera e del processo di produzione del wafer illustrando come una forma di realizzazione della presente invenzione possa essere integrata in questi processi.
La Fig. 8 illustra un sistema per entrambe l’ispezione in linea e fuori linea di una maschera in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione.
La Fig. 9 illustra un ulteriore sistema per l’ispezione di una maschera in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione.
Le Fig. 10 (a) – (c) illustrano un esempio di come un potenziale difetto della maschera possa avere effetto sulla finestra del processo del processo fotolitografico.
La Fig. 11 illustra il diagramma di un processo che rappresenta una forma di realizzazione dell’analizzatore di difetti della Fig. 8.
La Fig. 12 illustra una schermata di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui viene simulata una maschera con un difetto per stampare in 5 differenti insiemi di condizioni del fotoripetitore.
La Fig. 13 illustra una schermata che rappresenta l’interfaccia utente di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione.
La Fig. 14 illustra una schermata di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui la maschera che viene ispezionata è stata corretta OPC.
La Fig. 15 illustra un’ulteriore schermata di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui la maschera che viene ispezionata è stata corretta OPC, in cui è illustrato un dato in uscita correlato con la finestra del processo.
La Fig. 16 illustra una situazione in cui è illustrato da un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione che un difetto identificato della maschera non stampa in un insieme particolare di condizioni del fotoripetitore.
La Fig. 17 illustra svariate schermate di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui un’immagine simulata della maschera è confrontata con un’immagine simulata del progetto al fine di rilevare le aree di potenziale difetto.
La Fig. 18 illustra ancora un’altra schermata di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui la maschera che viene ispezionata è stata corretta OPC.
La Fig. 19 illustra svariate schermate di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui è dimostrato l’effetto dei difetti sulla finestra del processo.
La Fig. 20 illustra un’ulteriore schermata di un programma informatico che funziona secondo una forma di realizzazione della presente invenzione in cui un’immagine simulata della maschera è confrontata con un’immagine simulata del progetto.
Sebbene molti dettagli siano stati inclusi nella descrizione e nelle figure, l’invenzione è definita dall’ambito delle rivendicazioni. Soltanto le limitazioni riscontrate in quelle rivendicazioni si applicano all’invenzione.
4. Descrizione Dettagliata
La fotolitografia è un processo il cui dato in ingresso è una maschera e il cui dato in uscita consiste nei modelli stampati su un wafer. Il risultato stampato da una maschera è ciò di cui gli ingegneri progettisti, i litografi, e i fabbricanti della maschera hanno molta cura. Utilizzando i metodi anteriori, il solo modo di ispezionare questo risultato stampato era di eseguire un’esposizione reale del wafer e pertanto incorrere in costi potenzialmente non necessari in termini di tempo e di denaro. La presente invenzione risolve alcuni dei problemi di questi metodi anteriori fornendo l’ispezione della maschera che tiene in considerazione la stampabilità senza il bisogno delle fasi costose di esporre realmente un wafer. La presente invenzione è in grado di utilizzare un’immagine catturata di una maschera – che rappresenta in modo sufficientemente accurato la maschera fisica (vale a dire come da un microscopio ottico ad alta risoluzione o da un microscopio a scansione elettronica) – e di simulare utilizzando quell’immagine catturata l’esposizione del wafer che la maschera fornirebbe in un dato insieme di condizioni del fotoripetitore. Pertanto, quando è stata eseguita una ispezione iniziale della maschera alla ricerca di difetti e i potenziali difetti sono stati identificati, la presente invenzione può essere utilizzata per simulare l’esposizione del wafer in base alle immagini catturate delle aree della maschera che circondano i potenziali difetti. In questo modo, la stampabilità dei potenziali difetti può essere analizzata direttamente senza affrontare la spesa di una esposizione reale del wafer.
Inoltre, la simulazione può essere controllata per tenere in considerazione qualsiasi numero di parametri associati al processo fotolitografico, rendendo specifico in tal modo il processo di determinazione della stampabilità. Ancora di più, la simulazione di ciascun difetto può essere realizzata in corrispondenza di numerosi valori di determinate variabili del processo che potrebbero variare durante l’esposizione reale (come la defocalizzazione) al fine di determinare l’effetto che i potenziali difetti hanno sulla finestra del processo di fabbricazione del wafer. L’elaborazione successiva può anche essere modellizzata con accuratezza e con una piccola perdita di velocità calibrando il processo in modo da tenere in considerazione i parametri del processo fotosensibile e del processo di incisione.
Una descrizione dettagliata delle forme di realizzazione preferite è fornita relativamente alle figure nelle quali la Fig. 4 illustra, nella forma semplificata di un diagramma di flusso di un processo, un processo per ispezionare una maschera alla ricerca di difetti in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione. Il processo utilizza uno strumento di ispezione 400 e un generatore dell’immagine del fotoripetitore 410. Lo strumento di ispezione 400 può comprendere un dispositivo di acquisizione dell’immagine 430, un processore di rilevamento del difetto 440, e un generatore dell’immagine dell’area del difetto 442. In una forma di realizzazione, lo strumento di ispezione 400 può essere tutto compreso in quanto esso contiene ciascuno degli elementi precedentemente menzionati in un pacchetto. Questa configurazione dello strumento tutto compreso 400 viene utilizzata tipicamente nell’ispezione della maschera in linea. In un’altra forma di realizzazione, lo strumento 410 può comprendere un numero di elementi che esistono separatamente che si interfacciano tra loro come viene usato tipicamente nell’ispezione della maschera fuori linea. Per esempio, in una forma di realizzazione, il dispositivo di acquisizione dell’immagine 410 è un dispositivo separato dal processore di rilevamento del difetto 440.
Il dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 può comprendere un dispositivo di formazione dell’immagine ad alta risoluzione come un microscopio ottico ad alta risoluzione, un microscopio a scansione elettronica (SEM), un fascio ionico focalizzato, un microscopio a forza atomica, e un microscopio ottico in campo prossimo come è ben noto nella tecnica dell’ispezione della maschera. Il dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 esegue una scansione di tutta o di una porzione della maschera 420. Il dispositivo di acquisizione dell’immagine può anche comprendere un dispositivo come una videocamera CCD in grado di interfacciarsi con il tipo particolare di microscopio utilizzato e di digitalizzare le informazioni dell’immagine dal microscopio. Per esempio, può essere utilizzata una video camera CCD che crea dati di un’immagine in scala di grigi di n – bit che siano rappresentativi dell’immagine dal microscopio. I dati dell’immagine possono essere memorizzati in un formato come Windows BMP su qualsiasi tipo di supporto appropriato incluso un disco rigido di un computer, un CDROM, e un server.
Il processore di rilevamento del difetto 440 controlla il dispositivo di acquisizione dell’immagine 410. In una forma di realizzazione, il processore di rilevamento del difetto 440 fornisce i segnali di controllo che controllano la maniera in cui il dispositivo di acquisizione dell’immagine 410 esegue la scansione della maschera. Inoltre, il processore di rilevamento del difetto 440 confronta le immagini della maschera fornite dal dispositivo di acquisizione dell’immagine 410 con un insieme di criteri di potenziale difetto e determina quali aree della maschera contengono potenziali difetti. In una forma di realizzazione, il processore di rilevamento del difetto 440 comprende un computer che esegue un programma di istruzioni e che si interfaccia con il dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 così che la scansione della maschera sia fatta nella maniera desiderata. In una forma di realizzazione, il programma funziona in modo tale che un utente possa cambiare i parametri della scansione eseguita sulla maschera 420. In un’altra forma di realizzazione, il dispositivo di acquisizione dell’immagine 410 può essere sostituito con un’immagine preesistente di una maschera o di una porzione di una maschera. A tal fine, qualsiasi rappresentazione della maschera fisica 420 che sia in grado di essere analizzata tramite il processore di rilevamento del difetto 440 è accettabile come un dato in ingresso.
Il processore di rilevamento del difetto 440 controlla anche il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 che fornisce le immagini di quelle aree della maschera 420 che possono contenere i difetti. Per esempio, quando il dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 fornisce l’immagine in ingresso ottenuta dalla scansione della maschera 420 al processore di rilevamento del difetto 440, il processore del difetto 440 determina se quella porzione della maschera su cui è stata eseguita la scansione contiene qualche area di potenziale difetto in base ai criteri di difetto prefissati. Questi criteri, in una forma di realizzazione, possono essere cambiati da un utente del sistema. Se viene scoperto un potenziale difetto, il processore del difetto 440 invia un segnale al generatore dell’immagine dell’area del difetto per fornire un’immagine dell’area del difetto dell’area che circonda il potenziale difetto. Il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 fornisce pertanto i dati dell’immagine dell’area del difetto 444. In una forma di realizzazione, il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 può essere una parte del dispositivo di acquisizione dell’immagine 430, per esempio, il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 può comprendere la videocamera CCD del dispositivo di acquisizione dell’immagine 430. In un’altra forma di realizzazione, il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 può essere un dispositivo separato che riceve l’immagine in ingresso dal dispositivo di acquisizione dell’immagine 430.
Le forme di realizzazione dello strumento di ispezione 400 possono essere utilizzate per fornire i dati per il generatore dell’immagine del fotoripetitore 410 in numerosi modi. Innanzitutto, il dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 potrebbe eseguire una scansione della maschera intera 420 o di una porzione della maschera 420 senza alcun controllo da parte del processore di rilevamento del difetto 440 e memorizzare i dati dell’immagine risultanti in un dispositivo di memorizzazione 447 come un server dopo la digitalizzazione dei dati con un dispositivo di digitalizzazione 446 come un digitalizzatore di immagine. Questi stessi dati dell’immagine possono anche essere forniti direttamente al generatore dell’immagine del fotoripetitore 410 attraverso una trasmissione di dati in tempo reale. In secondo luogo, nel caso del dispositivo di acquisizione dell’immagine 430 che si trovi sotto il controllo del processore di rilevamento del difetto 440, il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 può fornire i dati dell’immagine dell’area del difetto 444 direttamente al generatore di immagine 410 attraverso una trasmissione di dati in tempo reale (ispezione in linea) o fornire i dati dell’immagine 444 al dispositivo di digitalizzazione 446 e successivamente al dispositivo di memorizzazione 447 per l’ispezione fuori linea in un secondo tempo.
Il generatore di immagine del fotoripetitore 410 comprende un dispositivo di ingresso 450 e un simulatore dell’immagine 460. Il dispositivo di ingresso 450, nel caso dei dati dell’immagine memorizzati 447, può comprendere qualsiasi hardware idoneo per leggere il tipo di supporto sul quale sono memorizzati i dati dell’immagine, incluso un disco rigido di computer, un lettore di CDROM, e un personal computer attaccato a un server attraverso una rete, tra l’altro. Nel caso di un trasferimento di dati dell’immagine in tempo reale dal generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 o dal dispositivo di acquisizione dell’immagine 430, il dispositivo di ingresso può comprendere un dispositivo di digitalizzazione come un digitalizzatore di immagine. Per esempio, in una forma di realizzazione il dispositivo di ingresso può comprendere un dispositivo digitalizzatore video a 8-bit come quelli che sono noti nella tecnica inclusi il MatroxTM Meteor TM e il PulsarTM. Il dispositivo di ingresso 450 riceve anche altri dati in ingresso come i dati in ingresso delle condizioni litografiche 445. In una forma di realizzazione, il simulatore dell’immagine 460 comprende un programma implementato al computer che accetta i dati dell’immagine memorizzati o trasmessi in tempo reale dal dispositivo di ingresso 450, e produce una simulazione dell’immagine del fotoripetitore 470 su un wafer per la maschera fisica 420. In questa forma di realizzazione implementata al computer, il programma simulatore dell’immagine 460 può essere eseguito su una varietà di piattaforme informatiche inclusi: un PC che utilizza il sistema operativo Windows 95TM o NTTM 4.0 con 128 MB di RAM e un microprocessore Pentium ProTM a 200 MHz, autonomo o limitato a una rete, e un computer postazione di lavoro SUNTM tra l’altro. In alcuni casi, la quantità di tempo necessaria per una forma di realizzazione del simulatore dell’immagine 460 per simulare un’immagine di una dimensione della matrice di CCD convenzionale è inferiore al secondo.
In una forma di realizzazione, lo strumento di ispezione 400 e il generatore dell’immagine del fotoripetitore 410 funzionano per produrre un’immagine simulata del fotoripetitore 470, un dato in uscita simulato della finestra del processo 480 per una maschera fisica 420, e/o altri dati in uscita correlati con la prestazione utilizzati per caratterizzare, definire o misurare l’effetto di un difetto(i) sulla prestazione del circuito integrato come segue. La maschera tipica 420 è innanzitutto ispezionata con lo strumento di ispezione 400. Lo strumento di ispezione 400 esegue una scansione della maschera fisica 420 alla ricerca di possibili difetti e il generatore dell’immagine dell’area del difetto 442, conformemente alla direzione dal processore di rilevamento del difetto 440, genera le immagini dell’area del difetto 432 di quelle aree della maschera contenenti possibili difetti. I dati dell’immagine dell’area del difetto 444 sono in seguito trasmessi al dispositivo di ingresso 450 in tempo reale, e/o memorizzati nel dispositivo di memorizzazione 447 attraverso il dispositivo di digitalizzazione 446 per un’ispezione successiva.
Il dispositivo di ingresso 450 riceve i dati dell’immagine dell’area del difetto 444 dal generatore dell’immagine dell’area del difetto 442 o dal dispositivo di memorizzazione 447. I dati dell’immagine dell’area del difetto 444 sono successivamente inviati al simulatore dell’immagine 460. Il simulatore dell’immagine 460 riceve il dato in ingresso delle condizioni litografiche 445. Il dato in ingresso delle condizioni litografiche 445 contiene i dati che sono specifici per le condizioni litografiche e i parametri del sistema ai quali la maschera fisica deve essere esposta successivamente se supera l’ispezione. Questi dati possono includere i parametri come l’apertura numerica del sistema (NA), il valore di coerenza del sistema (σ), la lunghezza d’onda dell’illuminazione che viene utilizzata nel sistema (λ), la defocalizzazione dell’esposizione, le aberrazioni della lente, le condizioni del substrato e le dimensioni critiche del progetto tra l’altro. Inoltre, il dato in ingresso sulle condizioni litografiche 445 può contenere una gamma di questi parametri. In questa maniera, la stampabilità di un difetto della maschera può essere analizzata attraverso una gamma di condizioni litografiche possibili, e può essere analizzato anche l’effetto di un potenziale difetto della maschera sulla finestra del processo.
In una forma di realizzazione, il simulatore dell’immagine 460 riceve i dati dell’immagine dell’area del difetto 444 dal dispositivo di ingresso 450 e il dato in ingresso delle condizioni litografiche 445, e genera un’immagine simulata del fotoripetitore 470 che è una simulazione dell’esposizione del wafer che l’area del difetto della maschera fisica 420 genererebbe se venisse eseguita un’esposizione litografica ottica nelle stesse condizioni del dato in ingresso delle condizioni litografiche 445. Analogamente, il simulatore dell’immagine 460 può generare una finestra simulata del processo 480 che rappresenta l’effetto che l’area del potenziale difetto ha sulla finestra del processo, e/o un esito della prestazione 482 come discusso sopra. Inoltre, in una forma di realizzazione, il simulatore dell’immagine 460 è in grado di generare un’immagine simulata del fotoripetitore 470 per un’area del potenziale difetto di una maschera di un numero di tipi differenti di progetti di maschera inclusi il campo chiaro, il campo oscuro, e i progetti di maschera a spostamento di fase attenuato. L’immagine simulata del fotoripetitore 470, la finestra simulata del processo 480, e/o l’esito della prestazione 482 possono essere ispezionati successivamente per determinare la stampabilità di qualsiasi area del potenziale difetto identificato senza affrontare realmente la spesa di esporre un wafer reale con la maschera, come sarà spiegato in maggior dettaglio relativamente alle Fig. 8 - 11. Infine, in altre forme di realizzazione, il simulatore dell’immagine 460 può prendere in considerazione i parametri associati al materiale fotosensibile da utilizzare e/o il processo di incisione da utilizzare sul wafer esposto al fine di simulare il risultato finale di questi processi come illustrato dal blocco 484 e discusso più completamente di seguito in relazione alla Fig.6.
Le Fig. 5(a) – (b) illustrano nella forma di un diagramma di flusso del processo, due forme di realizzazione del processo di simulazione dell’immagine utilizzato nella presente invenzione per fabbricare le immagini simulate del fotoripetitore di un wafer esposto. La Fig. 5(a) illustra una forma di realizzazione del processo come quella che sarebbe utilizzata su una maschera di progetto come dal simulatore dell’immagine del progetto 960 che deve essere descritto di seguito in relazione alla Fig. 9. La Fig. 5(b) illustra una forma di realizzazione del processo come verrebbe utilizzata su un’immagine catturata di una maschera fisica come dal simulatore dell’immagine 460 della Fig. 4, i simulatori dell’immagine 830 e 860 della Fig. 8, e il simulatore dell’immagine della maschera 950 e il simulatore dell’immagine del progetto 960 della Fig. 9. Prima di discutere le specifiche delle Fig. 5(a) – (b) tuttavia, sarebbe utile esporre qualcosa dello sfondo dietro i processi di simulazione illustrati più oltre.
In una visione d’insieme, il processo di simulazione come quello descritto relativamente alle Fig. 5(a) – (b) fa uso di quanto è indicato nella tecnica come il modello di Hopkins al fine di approssimare il processo della litografia ottica. Secondo il modello di Hopkins, in una impostazione sufficientemente generale, il processo della formazione dell’immagine parzialmente coerente (che è il processo esclusivo attualmente impiegato nella litografia ottica) può essere descritto dalla seguente equazione integrale non lineare:
(1)
in cui,
I(-) = l’immagine dell’intensità sul piano dell’immagine;
g(-) = immagine dell’ampiezza sul piano dell’immagine;
f(-) = oggetto di cui viene formata l’immagine (maschera);
K(-) = funzione di divisione di punto coerente – descrive le proprietà del sistema litografico;
J0(-) = funzione di intensità reciproca – descrive le proprietà di coerenza dell’illuminazione.
Tuttavia, l’equazione integrale non lineare di cui sopra è troppo complicata per essere applicata in modo efficiente ai modelli di circuito integrato realistici. Pertanto, le simulazioni dell’immagine da discutere relativamente alle Fig. 5(a) – (b) sono prodotte, in una forma di realizzazione, utilizzando un processo che è un’approssimazione semplificata del modello di Hopkins come quello applicato in modo specifico ai circuiti integrati. In questo processo, il modello di Hopkins viene prima effettivamente suddiviso in un numero di filtri passa basso che sono applicati ai dati in ingresso. Le immagini risultanti sono successivamente sommate per generare l’immagine simulata.
La premessa di base di questa approssimazione del modello di Hopkins è contenuta in Y. C. Pati et al., “Phase -shifting masks for microlithography: automated design and mask requirements", JOURNAL OF THE OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, Volume 11, Numero 9, pag. 2438-52, (Settembre 1994), che è incorporato nella presente per riferimento come se esposto completamente, and in Y.C. Pati et al., "Exploiting Structure in Fast Aerial Image Computation for Integrated Circuit Patterns", IEEE TRANSACTIONS ON SEMICONDUCTOR CIRCUIT MANUFACTURING, Volume 10, Numero 1, pag. 62-74, (Febbraio. 1997) (più oltre Pati et al.), che è anch’esso incorporato per riferimento nella presente come se esposto completamente.
Il metodo menzionato di sopra è noto come "Optimal Coherent Approximation’s" (OCA) o "Optimal Coherent Decompositions" (OCD). Questo metodo fa uso di una struttura che può essere estratta dal modello di Hopkins parzialmente coerente al fine di semplificare l’equazione a un primo ordine. La semplificazione al primo ordine ottenuta attraverso OCA utilizza il fatto che nel caso speciale in cui l’illuminazione è completamente coerente, il modello di Hopkins si riduce a:
(2)
in cui “*” indica l’operatore di convoluzione bidimensionale,
(3)
Pertanto, nel caso coerente il calcolo richiesto per calcolare l’immagine si riduce a O(N log2N) utilizzando la trasformata di Fourier veloce (FFT), in cui N è il numero di punti discreti del campione considerati. Questo fatto, combinato con l’utilizzo di una struttura inerente del circuito integrato per ridurre drasticamente il numero di calcoli
Da Inglese a Italiano: Plant 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase (by E.I. du Pont de Nemours US) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese PLANT 1-DEOXY-D-XYLULOSE 5-PHOSPHATE REDUCTOISOMERASE
Description
This application claims the benefit of U.S. Provisional Application No. 60/110,865, filed December 4, 1998.
FIELD OF THE INVENTION
This invention is in the field of plant molecular biology. More specifically, this invention pertains to nucleic acid fragments encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in plants and seeds.
BACKGROUND OF THE INVENTION
Isoprenoids comprise the largest family of natural products, including numerous secondary compounds which play different functional roles in plants as hormones, photosynthetic pigments, electron carriers, and structural components of membranes. The fundamental unit in isoprenoid biosynthesis, isopentenyl diphosphate (IPP), is normally synthesized by the condensation of acetyl CoA through the mevalonate pathway. In many organisms including several bacteria, algae and plant plastids, IPP is synthesized by a mevalonate-independent pathway. The initial step in this pathway is the condensation of pyruvate and glyceraldehyde 3-phosphate to form 1-deoxy-D-xylulose 4-phosphate. In the committed step towards IPP formation 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzes in a single step an intramolecular rearrangement and reduction of 1-deoxy-D-xylulose 4-phosphate to form 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate.
The E. coli 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase enzyme has only recently been identified. Comparison of the amino acid sequence of the E. coli 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase with those of Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli, Mycobacterium tuberculosis andSynechocystis sp. PCC6803 showed that there is little conservation among these sequences (Takahashi et al. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95:9879-9884).
SUMMARY OF THE INVENTION
The instant invention relates to isolated nucleic acid fragments encoding isopentenyl diphosphate biosynthetic enzymes. Specifically, this invention concerns an isolated nucleic acid fragment encoding a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase. In addition, this invention relates to a nucleic acid fragment that is complementary to the nucleic acid fragment encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase.
The application discloses an expression cassette comprising an isolated polynucleotide of the present invention operably linked to a promoter.
It also discloses a method for positive selection of a transformed cell comprising:
(a) transforming a host cell with the chimeric gene of the present invention or an expression cassette of the present invention; and
(b) growing the transformed host cell under conditions allowing expression of the polynucleotide in an amount sufficient to complement a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase null mutant to provide a positive selection means.
The present invention relates to an isolated nucleic acid fragment comprising: (a) a nucleic acid fragment encoding an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8; (b) a nucleic acid fragment consisting of a sequence selected from SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7; (c) a nucleic acid fragment which codes for a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide and which hybridises with (b), and which remains hybridised with (b) under wash conditions of 0.1X SSC and 0.1% SDS at 65°C ; or (d) a nucleic acid fragment which has a sequence which is complementary to (a), (b) or (c).
It is preferred that the isolated nucleic acid fragments of the claimed invention consist of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 and 7 that codes for the polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 and 8.
The present invention relates to a chimeric gene comprising an isolated nucleic acid fragment of the present invention operably linked to suitable regulatory sequences.
The present invention relates to an isolated host cell comprising a chimeric gene of the present invention. The host cell may be eukaryotic, such as a yeast or a plant cell, or prokaryotic, such as a bacterial cell.
Also disclosed is a process for producing an isolated host cell comprising a chimeric gene of the present invention or an isolated polynucleotide of the present invention, the process comprising either transforming or transfecting an isolated compatible host cell with a chimeric gene or isolated polynucleotide of the present invention.
Also disclosed is a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide of at least 200 amino acids comprising at least 93%, more preferably at least about 95%, and more preferably at least about 98% homology based on the Clustal method of alignment compared to a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 and 8.
Also disclosed is a method of selecting an isolated polynucleotide that affects the level of expression of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide in a host cell, the method comprising the steps of: (a) constructing an isolated polynucleotide of the present invention or an isolated chimeric gene of the present invention; (b) introducing the isolated polynucleotide or the isolated chimeric gene into a host cell; (c) measuring the level a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide in the host cell containing the isolated polynucleotide; and (d) comparing the level of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide in the host cell containing the isolated polynucleotide with the level of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide in a host cell that does not contain the isolated polynucleotide.
Also disclosed is a method of obtaining a nucleic acid fragment encoding a substantial portion of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide gene, comprising the steps of: synthesizing an oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence of at least one of 40 (preferably at least one of 30) contiguous nucleotides derived from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19 and the complement of such nucleotide sequences; and amplifying a nucleic acid fragment (preferably a cDNA inserted in a cloning vector) using the oligonucleotide primer. The amplified nucleic acid fragment preferably will encode a portion of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase amino acid sequence.
Also disclosed is a method of obtaining a nucleic acid fragment encoding all or a substantial portion of the amino acid sequence encoding a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase polypeptide comprising the steps of: probing a cDNA or genomic library with an isolated polynucleotide of the present invention; identifying a DNA clone that hybridizes with an isolated polynucleotide of the present invention; isolating the identified DNA clone; and sequencing the cDNA or genomic fragment that comprises the isolated DNA clone.
Also disclosed is a method for evaluating at least one compound for its ability to inhibit the activity of a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, the method comprising the steps of: (a) transforming a host cell with a chimeric gene comprising a nucleic acid fragment encoding a 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, operably linked to suitable regulatory sequences; (b) growing the transformed host cell under conditions that are suitable for expression of the chimeric gene wherein expression of the chimeric gene results in production of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in the transformed host cell; (c) optionally purifying the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase expressed by the transformed host cell; (d) treating the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase with a compound to be tested; and (e) comparing the activity of the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase that has been treated with a test compound to the activity of an untreated 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, thereby selecting compounds with potential for inhibitory activity.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING AND SEQUENCE DESCRIPTIONS
The invention can be more fully understood from the following detailed description and the accompanying drawing and Sequence Listing which form a part of this application.
Figure 1 shows a comparison of the amino acid sequences of the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from corn clone p0004.cb1hh74r (SEQ ID NO:16), rice clone rlr6.pk0073.d5 (SEQ ID NO:6), a soybean contig assembled from clones smllc.pk001.c15, sml1c.pk005.a24, sl1.pk0021.a6, sl2.pk124.p17, sl1.pk0036.a5, sl2.pk0111.c9, sl1.pk152.i19, and sl2.pk0039.d4 (SEQ ID NO:8), a soybean contig assembled from clones ses2w.pk0029.e5, sgc3c.pk001.d16, and sr1.pk0008.d1:fis (SEQ ID NO:18), wheat clone wlm12.pk0003.d11:fis (SEQ ID NO:20), Arabidopsis thaliana (NCBI General Identifier No. 4886307; SEQ ID NO:21), and Mentha x piperita (NCBI General Identifier No. 4581856; SEQ ID NO:22). Amino acids conserved among all sequences are indicated with an asterisk (*) on the top row; dashes are used by the program to maximize alignment of the sequences.
Table 1 lists the polypeptides that are described herein, the designation of the cDNA clones that comprise the nucleic acid fragments encoding polypeptides representing all or a substantial portion of these polypeptides, and the corresponding identifier (SEQ ID NO:) as used in the attached Sequence Listing. The sequence descriptions and Sequence Listing attached hereto comply with the rules governing nucleotide and/or amino acid sequence disclosures in patent applications as set forth in 37 C.F.R. §1.821-1.825.
TABLE 1
Isopentenyl Diphosphate Biosynthetic Enzymes
SEQ ID NO:
Protein Clone Designation (Nucleotide) (Amino Acid)
Corn 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 1 2
5-phosphate reductoisomerase p0004.cb1hh74r
p0012.cg1ac07r
p0006.cbyvo28r
Corn 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 3 4
5-phosphate reductoisomerase cen3n.pk0157.e12
cr1n.pk0095.g3
cho1c.pk004.f12
csi1.pk0041.f11
Rice 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase rlr6.pk0073.d5 5 6
Soybean 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 7 8
5-phosphate reductoisomerase sml1c.pk001.c15
sml1c.pk005.a24
sl1.pk0021.a6
sl2.pk124.p17
sl1.pk0036.a5.
sl2.pk0111.c9
sl1.pk152.i19
sl2.pk0039.d4
Soybean 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 9 10
5-phosphate reductoisomerase sr1.pk0008.d1
sr1.pk0007.c11
srm.pk0014.f8
Wheat 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 11 12
5-phosphate reductoisomerase wlm12.pk0003.d11
wr1.pk0084.a4
Wheat 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase Wlm24.pk0014.d7 13 14
Corn 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase p0004.cb1hh74r 15 16
Soybean 1-deoxy-D-xylulose Contig of: 17 18
5-phosphate reductoisomerase ses2w.pk0029.e5
sgc3c.pk001.d16
sr1.pk0008.d1:fis
Wheat 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase wlm12.pk0003.d11:fis 19 20
The Sequence Listing contains the one letter code for nucleotide sequence characters and the three letter codes for amino acids as defined in conformity with the IUPAC-IUBMB standards described in Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) and in the Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984). The symbols and format used for nucleotide and amino acid sequence data comply with the rules set forth in 37 C.F.R. §1.822.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the context of this disclosure, a number of terms shall be utilized. As used herein, a "polynucleotide" is a nucleotide sequence such as a nucleic acid fragment. A polynucleotide may be a polymer of RNA or DNA that is single- or double-stranded, that optionally contains synthetic, non-natural or altered nucleotide bases. A polynucleotide in the form of a polymer of DNA may be comprised of one or more segments of cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, or mixtures thereof.
As used herein, "contig" refers to a nucleotide sequence that is assembled from two or more constituent nucleotide sequences that share common or overlapping regions of sequence homology. For example, the nucleotide sequences of two or more nucleic acid fragments can be compared and aligned in order to identify common or overlapping sequences. Where common or overlapping sequences exist between two or more nucleic acid fragments, the sequences (and thus their corresponding nucleic acid fragments) can be assembled into a single contiguous nucleotide sequence.
As used herein, "substantially similar" refers to nucleic acid fragments wherein changes in one or more nucleotide bases results in substitution of one or more amino acids, but do not affect the functional properties of the polypeptide encoded by the nucleotide sequence. "Substantially similar" also refers to nucleic acid fragments wherein changes in one or more nucleotide bases does not affect the ability of the nucleic acid fragment to mediate alteration of gene expression by gene silencing through for example antisense or co-suppression technology. "Substantially similar" also refers to modifications of the nucleic acid fragments of the instant invention such as deletion or insertion of one or more nucleotides that do not substantially affect the functional properties of the resulting transcript vis-à-vis the ability to mediate gene silencing or alteration of the functional properties of the resulting protein molecule.
Substantially similar nucleic acid fragments may be selected by screening nucleic acid fragments representing subfragments or modifications of the nucleic acid fragments of the instant invention, wherein one or more nucleotides are substituted, deleted and/or inserted, for their ability to affect the level of the polypeptide encoded by the unmodified nucleic acid fragment in a plant or plant cell. For example, a substantially similar nucleic acid fragment representing at least one of 30 contiguous nucleotides derived from the instant nucleic acid fragment can be constructed and introduced into a plant or plant cell. The level of the polypeptide encoded by the unmodified nucleic acid fragment present in a plant or plant cell exposed to the substantially similar nucleic fragment can then be compared to the level of the polypeptide in a plant or plant cell that is not exposed to the substantially similar nucleic acid fragment.
For example, it is well known in the art that antisense suppression and co-suppression of gene expression may be accomplished using nucleic acid fragments representing less than the entire coding region of a gene, and by nucleic acid fragments that do not share 100% sequence identity with the gene to be suppressed. Moreover, alterations in a nucleic acid fragment which result in the production of a chemically equivalent amino acid at a given site, but do not effect the functional properties of the encoded polypeptide, are well known in the art. Thus, a codon for the amino acid alanine, a hydrophobic amino acid, may be substituted by a codon encoding another less hydrophobic residue, such as glycine, or a more hydrophobic residue, such as valine, leucine, or isoleucine. Similarly, changes which result in substitution of one negatively charged residue for another, such as aspartic acid for glutamic acid, or one positively charged residue for another, such as lysine for arginine, can also be expected to produce a functionally equivalent product. Nucleotide changes which result in alteration of the N-terminal and C-terminal portions of the polypeptide molecule would also not be expected to alter the activity of the polypeptide. Each of the proposed modifications is well within the routine skill in the art, as is determination of retention of biological activity of the encoded products. Consequently, an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence of at least one of 60 (preferably at least one of 40, most preferably at least one of 30) contiguous nucleotides derived from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, and the complement of such nucleotide sequences may be used in methods of selecting an isolated polynucleotide that affects the expression of a polypeptide in a plant cell. A method of selecting an isolated polynucleotide that affects the level of expression of a polypeptide, such as 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in a host cell (eukaryotic, such as plant or yeast, prokaryotic such as bacterial, or viral) may comprise the steps of: constructing an isolated polynucleotide of the present invention or an isolated chimeric gene of the present invention; introducing the isolated polynucleotide or the isolated chimeric gene into a host cell; measuring the level a polypeptide in the host cell containing the isolated polynucleotide; and comparing the level of a polypeptide in the host cell containing the isolated polynucleotide with the level of a polypeptide in a host cell that does not contain the isolated polynucleotide.
Moreover, substantially similar nucleic acid fragments may also be characterized by their ability to hybridize. Estimates of such homology are provided by either DNA-DNA or DNA-RNA hybridization under conditions of stringency as is well understood by those skilled in the art (Hames and Higgins, Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.). Stringency conditions can be adjusted to screen for moderately similar fragments, such as homologous sequences from distantly related organisms, to highly similar fragments, such as genes that duplicate functional enzymes from closely related organisms. Post-hybridization washes determine stringency conditions. One set of preferred conditions uses a series of washes starting with 6X SSC, 0.5% SDS at room temperature for 15 min, then repeated with 2X SSC, 0.5% SDS at 45°C for 30 min, and then repeated twice with 0.2X SSC, 0.5% SDS at 50°C for 30 min. A more preferred set of stringent conditions uses higher temperatures in which the washes are identical to those above except for the temperature of the final two 30 min washes in 0.2X SSC, 0.5% SDS was increased to 60°C. Another preferred set of highly stringent conditions uses two final washes in 0.1X SSC, 0.1% SDS at 65°C.
Substantially similar nucleic acid fragments may also be characterized by the percent identity of the amino acid sequences that they encode to the amino acid sequences disclosed herein, as determined by algorithms commonly employed by those skilled in this art. Suitable nucleic acid fragments encode polypeptides that are at least about 70% identical, or at least about 80% identical to the amino acid sequences reported herein. Nucleic acid fragments which encode amino acid sequences that are at least about 85% identical to the amino acid sequences reported herein are disclosed. Other nucleic acid fragments encode amino acid sequences that are at least about 90% identical to the amino acid sequences reported herein. Others are nucleic acid fragments that encode amino acid sequences that are at least 93% identical to the amino acid sequences reported herein. Suitable nucleic acid fragments not only have the above homologies but typically encode a polypeptide having at least about 50 amino acids, preferably at least about 100 amino acids, more preferably at least about 150 amino acids, still more preferably at least about 200 amino acids, and most preferably at least about 250 amino acids. Sequence alignments and percent identity calculations were performed using the Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Multiple alignment of the sequences was performed using the Clustal method of alignment (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) with the default parameters (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Default parameters for pairwise alignments using the Clustal method were KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 and DIAGONALS SAVED=5.
A "substantial portion" of an amino acid or nucleotide sequence comprises an amino acid or a nucleotide sequence that is sufficient to afford putative identification of the protein or gene that the amino acid or nucleotide sequence comprises. Amino acid and nucleotide sequences can be evaluated either manually by one skilled in the art, or by using computer-based sequence comparison and identification tools that employ algorithms such as BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403 -410; see also www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). In general, a sequence of ten or more contiguous amino acids or thirty or more contiguous nucleotides is necessary in order to putatively identify a polypeptide or nucleic acid sequence as homologous to a known protein or gene. Moreover, with respect to nucleotide sequences, gene-specific oligonucleotide probes comprising 30 or more contiguous nucleotides may be used in sequence-dependent methods of gene identification (e.g., Southern hybridization) and isolation (e.g., in situ hybridization of bacterial colonies or bacteriophage plaques). In addition, short oligonucleotides of 12 or more nucleotides may be used as amplification primers in PCR in order to obtain a particular nucleic acid fragment comprising the primers. Accordingly, a "substantial portion" of a nucleotide sequence comprises a nucleotide sequence that will afford specific identification and/or isolation of a nucleic acid fragment comprising the sequence. The instant specification teaches amino acid and nucleotide sequences encoding polypeptides that comprise one or more particular plant proteins. The skilled artisan, having the benefit of the sequences as reported herein, may now use all or a substantial portion of the disclosed sequences for purposes known to those skilled in this art.
"Codon degeneracy" refers to divergence in the genetic code permitting variation of the nucleotide sequence without effecting the amino acid sequence of an encoded polypeptide. Accordingly, the instant invention relates to any nucleic acid fragment comprising a nucleotide sequence that encodes all or a substantial portion of the amino acid sequences set forth herein. The skilled artisan is well aware of the "codon-bias" exhibited by a specific host cell in usage of nucleotide codons to specify a given amino acid. Therefore, when synthesizing a nucleic acid fragment for improved expression in a host cell, it is desirable to design the nucleic acid fragment such that its frequency of codon usage approaches the frequency of preferred codon usage of the host cell.
"Synthetic nucleic acid fragments" can be assembled from oligonucleotide building blocks that are chemically synthesized using procedures known to those skilled in the art. These building blocks are ligated and annealed to form larger nucleic acid fragments which may then be enzymatically assembled to construct the entire desired nucleic acid fragment "Chemically synthesized", as related to nucleic acid fragment, means that the component nucleotides were assembled in vitro. Manual chemical synthesis of nucleic acid fragments may be accomplished using well established procedures, or automated chemical synthesis can be performed using one of a number of commercially available machines. Accordingly, the nucleic acid fragments can be tailored for optimal gene expression based on optimization of nucleotide sequence to reflect the codon bias of the host cell. The skilled artisan appreciates the likelihood of successful gene expression if codon usage is biased towards those codons favored by the host. Determination of preferred codons can be based on a survey of genes derived from the host cell where sequence information is available.
"Gene" refers to a nucleic acid fragment that expresses a specific protein, including regulatory sequences preceding (5' non-coding sequences) and following (3' non-coding sequences) the coding sequence. "Native gene" refers to a gene as found in nature with its own regulatory sequences. "Chimeric gene" refers any gene that is not a native gene, comprising regulatory and coding sequences that are not found together in nature. Accordingly, a chimeric gene may comprise regulatory sequences and coding sequences that are derived from different sources, or regulatory sequences and coding sequences derived from the same source, but arranged in a manner different than that found in nature. "Endogenous gene" refers to a native gene in its natural location in the genome of an organism. A "foreign" gene refers to a gene not normally found in the host organism, but that is introduced into the host organism by gene transfer. Foreign genes can comprise native genes inserted into a non-native organism, or chimeric genes. A "transgene" is a gene that has been introduced into the genome by a transformation procedure.
"Coding sequence" refers to a nucleotide sequence that codes for a specific amino acid sequence. "Regulatory sequences" refer to nucleotide sequences located upstream (5' non-coding sequences), within, or downstream (3' non-coding sequences) of a coding sequence, and which influence the transcription, RNA processing or stability, or translation of the associated coding sequence. Regulatory sequences may include promoters, translation leader sequences, introns, and polyadenylation recognition sequences.
"Promoter" refers to a nucleotide sequence capable of controlling the expression of a coding sequence or functional RNA. In general, a coding sequence is located 3' to a promoter sequence. The promoter sequence consists of proximal and more distal upstream elements, the latter elements often referred to as enhancers. Accordingly, an "enhancer" is a nucleotide sequence which can stimulate promoter activity and may be an innate element of the promoter or a heterologous element inserted to enhance the level or tissue-specificity of a promoter. Promoters may be derived in their entirety from a native gene, or be composed of different elements derived from different promoters found in nature, or even comprise synthetic nucleotide segments. It is understood by those skilled in the art that different promoters may direct the expression of a gene in different tissues or cell types, or at different stages of development, or in response to different environmental conditions. Promoters which cause a nucleic acid fragment to be expressed in most cell types at most times are commonly referred to as "constitutive promoters". New promoters of various types useful in plant cells are constantly being discovered; numerous examples may be found in the compilation by Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. It is further recognized that since in most cases the exact boundaries of regulatory sequences have not been completely defined, nucleic acid fragments of different lengths may have identical promoter activity.
The "translation leader sequence" refers to a nucleotide sequence located between the promoter sequence of a gene and the coding sequence. The translation leader sequence is present in the fully processed mRNA upstream of the translation start sequence. The translation leader sequence may affect processing of the primary transcript to mRNA, mRNA stability or translation efficiency. Examples of translation leader sequences have been described (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236).
The "3' non-coding sequences" refer to nucleotide sequences located downstream of a coding sequence and include polyadenylation recognition sequences and other sequences encoding regulatory signals capable of affecting mRNA processing or gene expression. The polyadenylation signal is usually characterized by affecting the addition of polyadenylic acid tracts to the 3' end of the mRNA precursor. The use of different 3' non-coding sequences is exemplified by Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680.
"RNA transcript" refers to the product resulting from RNA polymerase-catalyzed transcription of a DNA sequence. When the RNA transcript is a perfect complementary copy of the DNA sequence, it is referred to as the primary transcript or it may be a RNA sequence derived from posttranscriptional processing of the primary transcript and is referred to as the mature RNA. "Messenger RNA (mRNA)" refers to the RNA that is without introns and that can be translated into polypeptide by the cell. "cDNA" refers to a double-stranded DNA that is complementary to and derived from mRNA. "Sense" RNA refers to an RNA transcript that includes the mRNA and so can be translated into a polypeptide by the cell. "Antisense RNA" refers to an RNA transcript that is complementary to all or part of a target primary transcript or mRNA and that blocks the expression of a target gene (see U.S. Patent No. 5,107,065). The complementarity of an antisense RNA may be with any part of the specific nucleotide sequence, i.e., at the 5' non-coding sequence, 3' non-coding sequence, introns, or the coding sequence. "Functional RNA" refers to sense RNA, antisense RNA, ribozyme RNA, or other RNA that may not be translated but yet has an effect on cellular processes.
The term "operably linked" refers to the association of two or more nucleic acid fragments on a single nucleic acid fragment so that the function of one is affected by the other. For example, a promoter is operably linked with a coding sequence when it is capable of affecting the expression of that coding sequence (i.e., that the coding sequence is under the transcriptional control of the promoter). Coding sequences can be operably linked to regulatory sequences in sense or antisense orientation.
The term "expression", as used herein, refers to the transcription and stable accumulation of sense (mRNA) or antisense RNA derived from the nucleic acid fragment of the invention. Expression may also refer to translation of mRNA into a polypeptide. "Antisense inhibition" refers to the production of antisense RNA transcripts capable of suppressing the expression of the target protein. "Overexpression" refers to the production of a gene product in transgenic organisms that exceeds levels of production in normal or non-transformed organisms. "Co-suppression" refers to the production of sense RNA transcripts capable of suppressing the expression of identical or substantially similar foreign or endogenous genes (U.S. Patent No. 5,231,020, incorporated herein by reference).
"Altered levels" refers to the production of gene product(s) in transgenic organisms in amounts or proportions that differ from that of normal or non-transformed organisms.
"Mature" protein refers to a post-translationally processed polypeptide; i.e., one from which any pre- or propeptides present in the primary translation product have been removed. "precursor" protein refers to the primary product of translation of mRNA; i.e., with pre- and propeptides still present. Pre- and propeptides may be but are not limited to intracellular localization signals.
A "chloroplast transit peptide" is an amino acid sequence which is translated in conjunction with a protein and directs the protein to the chloroplast or other plastid types present in the cell in which the protein is made. "Chloroplast transit sequence" refers to a nucleotide sequence that encodes a chloroplast transit peptide. A "signal peptide" is an amino acid sequence which is translated in conjunction with a protein and directs the protein to the secretory system (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53). If the protein is to be directed to a vacuole, a vacuolar targeting signal (supra) can further be added, or if to the endoplasmic reticulum, an endoplasmic reticulum retention signal (supra) may be added. If the protein is to be directed to the nucleus, any signal peptide present should be removed and instead a nuclear localization signal included (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632).
"Transformation" refers to the transfer of a nucleic acid fragment into the genome of a host organism, resulting in genetically stable inheritance. Host organisms containing the transformed nucleic acid fragments are referred to as "transgenic" organisms. Examples of methods of plant transformation include Agrobacterium-mediated transformation (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) and particle-accelerated or "gene gun" transformation technology (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; U.S. Patent No. 4,945,050.
Standard recombinant DNA and molecular cloning techniques used herein are well known in the art and are described more fully in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (hereinafter "Maniatis").
Nucleic acid fragments encoding at least a portion of several isopentenyl diphosphate biosynthetic enzymes have been isolated and identified by comparison of random plant cDNA sequences to public databases containing nucleotide and protein sequences using the BLAST algorithms well known to those skilled in the art. The nucleic acid fragments of the instant invention may be used to isolate cDNAs and genes encoding homologous proteins from the same or other plant species. Isolation of homologous genes using sequence-dependent protocols is well known in the art. Examples of sequence-dependent protocols include, but are not limited to, methods of nucleic acid hybridization, and methods of DNA and RNA amplification as exemplified by various uses of nucleic acid amplification technologies (e.g., polymerase chain reaction, ligase chain reaction).
For example, genes encoding other 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerases, either as cDNAs or genomic DNAs, could be isolated directly by using all or a portion of the instant nucleic acid fragments as DNA hybridization probes to screen libraries from any desired plant employing methodology well known to those skilled in the art. Specific oligonucleotide probes based upon the instant nucleic acid sequences can be designed and synthesized by methods known in the art (Maniatis). Moreover, the entire sequences can be used directly to synthesize DNA probes by methods known to the skilled artisan such as random primer DNA labeling, nick translation, or end-labeling techniques, or RNA probes using available in vitro transcription systems. In addition, specific primers can be designed and used to amplify a part or all of the instant sequences. The resulting amplification products can be labeled directly during amplification reactions or labeled after amplification reactions, and used as probes to isolate full length cDNA or genomic fragments under conditions of appropriate stringency.
In addition, two short segments of the instant nucleic acid fragments may be used in polymerase chain reaction protocols to amplify longer nucleic acid fragments encoding homologous genes from DNA or RNA. The polymerase chain reaction may also be performed on a library of cloned nucleic acid fragments wherein the sequence of one primer is derived from the instant nucleic acid fragments, and the sequence of the other primer takes advantage of the presence of the polyadenylic acid tracts to the 3' end of the mRNA precursor encoding plant genes. Alternatively, the second primer sequence may be based upon sequences derived from the cloning vector. For example, the skilled artisan can follow the RACE protocol (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8998-9002) to generate cDNAs by using PCR to amplify copies of the region between a single point in the transcript and the 3' or 5' end. Primers oriented in the 3' and 5' directions can be designed from the instant sequences. Using commercially available 3' RACE or 5' RACE systems (BRL), specific 3' or 5' cDNA fragments can be isolated (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673-5677; Loh et al. (1989) Science 243:217-220). Products generated by the 3' and 5' RACE procedures can be combined to generate full-length cDNAs (Frohman and Martin (1989) Techniques 1:165). Consequently, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of at least one of 60 (preferably one of at least 40, most preferably one of at least 30) contiguous nucleotides derived from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, and the complement of such nucleotide sequences may be used in such methods to obtain a nucleic acid fragment encoding a substantial portion of an amino acid sequence of a polypeptide. A nucleic acid fragment encoding a substantial portion of a polypeptide of a gene (such as 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerases) preferably a substantial portion of a plant polypeptide of a gene may be obtained by a method comprising the steps of: synthesizing an oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence of at least one of 60 (preferably at least one of 40, most preferably at least one of 30) contiguous nucleotides derived from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, and the complement of such nucleotide sequences; and amplifying a nucleic acid fragment (preferably a cDNA inserted in a cloning vector) using the oligonucleotide primer. The amplified nucleic acid fragment preferably will encode a portion of a polypeptide.
Availability of the instant nucleotide and deduced amino acid sequences facilitates immunological screening of cDNA expression libraries. Synthetic peptides representing portions of the instant amino acid sequences may be synthesized. These peptides can be used to immunize animals to produce polyclonal or monoclonal antibodies with specificity for peptides or proteins comprising the amino acid sequences. These antibodies can be then be used to screen cDNA expression libraries to isolate full-length cDNA clones of interest (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1-34; Maniatis).
The nucleic acid fragments of the instant invention may be used to create transgenic plants in which the disclosed polypeptides are present at higher or lower levels than normal or in cell types or developmental stages in which they are not normally found This would have the effect of altering the level of plastid IPP in those cells. Because this mevalonate-independent pathway appears to be unique to microorganisms and plant plastids inhibitors of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerases should have no affect on animals making this enzyme an excellent herbicide candidate. Overexpression of the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase gene will produce the active enzyme for high-throughput screening to find inhibitors for this enzyme. These inhibitors may lead to the discovery of novel herbicides.
Overexpression of the proteins of the instant invention may be accomplished by first constructing a chimeric gene in which the coding region is operably linked to a promoter capable of directing expression of a gene in the desired tissues at the desired stage of development. For reasons of convenience, the chimeric gene may comprise promoter sequences and translation leader sequences derived from the same genes. 3' Non-coding sequences encoding transcription termination signals may also be provided. The instant chimeric gene may also comprise one or more introns in order to facilitate gene expression.
Plasmid vectors comprising the instant chimeric gene can then be constructed. The choice of plasmid vector is dependent upon the method that will be used to transform host plants. The skilled artisan is well aware of the genetic elements that must be present on the plasmid vector in order to successfully transform, select and propagate host cells containing the chimeric gene. The skilled artisan will also recognize that different independent transformation events will result in different levels and patterns of expression (Jones et al. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), and thus that multiple events must be screened in order to obtain lines displaying the desired expression level and pattern. Such screening may be accomplished by Southern analysis of DNA, Northern analysis of mRNA expression, Western analysis of protein expression, or phenotypic analysis.
For some applications it may be useful to direct the instant polypeptide to different cellular compartments, or to facilitate its secretion from the cell. It is thus envisioned that the chimeric gene described above may be further supplemented by altering the coding sequence to encode the instant polypeptide with appropriate intracellular targeting sequences such as transit sequences (Keegstra (1989) Cell 56:247-253), signal sequences or sequences encoding endoplasmic reticulum localization (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53), or nuclear localization signals (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632) added and/or with targeting sequences that are already present removed. While the references cited give examples of each of these, the list is not exhaustive and more targeting signals of utility may be discovered in the future.
It may also be desirable to reduce or eliminate expression of genes encoding the instant polypeptides in plants for some applications. In order to accomplish this, a chimeric gene designed for co-suppression of the instant polypeptide can be constructed by linking a gene or gene fragment encoding that polypeptide to plant promoter sequences. Alternatively, a chimeric gene designed to express antisense RNA for all or part of the instant nucleic acid fragment can be constructed by linking the gene or gene fragment in reverse orientation to plant promoter sequences. Either the co-suppression or antisense chimeric genes could be introduced into plants via transformation wherein expression of the corresponding endogenous genes are reduced or eliminated.
Molecular genetic solutions to the generation of plants with altered gene expression have a decided advantage over more traditional plant breeding approaches. Changes in plant phenotypes can be produced by specifically inhibiting expression of one or more genes by antisense inhibition or cosuppression (U.S. Patent Nos. 5,190,931,5,107,065 and 5,283,323). An antisense or cosuppression construct would act as a dominant negative regulator of gene activity. While conventional mutations can yield negative regulation of gene activity these effects are most likely recessive. The dominant negative regulation available with a transgenic approach may be advantageous from a breeding perspective. In addition, the ability to restrict the expression of specific phenotype to the reproductive tissues of the plant by the use of tissue specific promoters may confer agronomic advantages relative to conventional mutations which may have an effect in all tissues in which a mutant gene is ordinarily expressed.
The person skilled in the art will know that special considerations are associated with the use of antisense or cosuppression technologies in order to reduce expression of particular genes. For example, the proper level of expression of sense or antisense genes may require the use of different chimeric genes utilizing different regulatory elements known to the skilled artisan. Once transgenic plants are obtained by one of the methods described above, it will be necessary to screen individual transgenics for those that most effectively display the desired phenotype. Accordingly, the skilled artisan will develop methods for screening large numbers of transformants. The nature of these screens will generally be chosen on practical grounds, and is not an inherent part of the invention. For example, one can screen by looking for changes in gene expression by using antibodies specific for the protein encoded by the gene being suppressed, or one could establish assays that specifically measure enzyme activity. A preferred method will be one which allows large numbers of samples to be processed rapidly, since it will be expected that a large number of transformants will be negative for the desired phenotype.
The instant polypeptides (or portions thereof) may be produced in heterologous host cells, particularly in the cells of microbial hosts, and can be used to prepare antibodies to the these proteins by methods well known to those skilled in the art. The antibodies are useful for detecting the polypeptides of the instant invention in situin cells or in vitro in cell extracts. Preferred heterologous host cells for production of the instant polypeptides are microbial hosts. Microbial expression systems and expression vectors containing regulatory sequences that direct high level expression of foreign proteins are well known to those skilled in the art. Any of these could be used to construct a chimeric gene for production of the instant polypeptides. This chimeric gene could then be introduced into appropriate microorganisms via transformation to provide high level expression of the encoded 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase. An example of a vector for high level expression of the instant polypeptides in a bacterial host is provided (Example 6).
Additionally, the instant polypeptides can be used as a targets to facilitate design and/or identification of inhibitors of those enzymes that may be useful as herbicides. This is desirable because the polypeptide described herein catalyzes isopentenyl diphosphate synthesis via the mevalonate-independent pathway. Accordingly, inhibition of the activity of the enzyme described herein could lead to inhibition of plant growth. Accordingly, inhibition of the activity of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase could lead to inhibition of plant growth. Thus, the instant polypeptides could be appropriate for new herbicide discovery and design.
All or a substantial portion of the nucleic acid fragments of the instant invention may also be used as probes for genetically and physically mapping the genes that they are a part of, and as markers for traits linked to those genes. Such information may be useful in plant breeding in order to develop lines with desired phenotypes. For example, the instant nucleic acid fragments may be used as restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers. Southern blots (Maniatis) of restriction-digested plant genomic DNA may be probed with the nucleic acid fragments of the instant invention. The resulting banding patterns may then be subjected to genetic analyses using computer programs such as MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181) in order to construct a genetic map. In addition, the nucleic acid fragments of the instant invention may be used to probe Southern blots containing restriction endonuclease-treated genomic DNAs of a set of individuals representing parent and progeny of a defined genetic cross. Segregation of the DNA polymorphisms is noted and used to calculate the position of the instant nucleic acid sequence in the genetic map previously obtained using this population (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
The production and use of plant gene-derived probes for use in genetic mapping is described in Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41. Numerous publications describe genetic mapping of specific cDNA clones using the methodology outlined above or variations thereof. For example, F2 intercross populations, backcross populations, randomly mated populations, near isogenic lines, and other sets of individuals may be used for mapping. Such methodologies are well known to those skilled in the art.
Nucleic acid probes derived from the instant nucleic acid sequences may also be used for physical mapping (i.e., placement of sequences on physical maps; see Hoheisel et al. In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, and references cited therein).
In another embodiment, nucleic acid probes derived from the instant nucleic acid sequences may be used in direct fluorescence in situ hybridization (FISH) mapping (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Although current methods of FISH mapping favor use of large clones (several to several hundred KB; see Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), improvements in sensitivity may allow performance of FISH mapping using shorter probes.
A variety of nucleic acid amplification-based methods of genetic and physical mapping may be carried out using the instant nucleic acid sequences. Examples include allele-specific amplification (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), polymorphism of PCR-amplified fragments (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), allele-specific ligation (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), nucleotide extension reactions (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) and Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). For these methods, the sequence of a nucleic acid fragment is used to design and produce primer pairs for use in the amplification reaction or in primer extension reactions. The design of such primers is well known to those skilled in the art. In methods employing PCR-based genetic mapping, it may be necessary to identify DNA sequence differences between the parents of the mapping cross in the region corresponding to the instant nucleic acid sequence. This, however, is generally not necessary for mapping methods.
Loss of function mutant phenotypes may be identified for the instant cDNA clones either by targeted gene disruption protocols or by identifying specific mutants for these genes contained in a maize population carrying mutations in all possible genes (Ballinger and Benzer (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9402-940.6;Koes et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:8149-8153; Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84). The latter approach may be accomplished in two ways. First, short segments of the instant nucleic acid fragments may be used in polymerase chain reaction protocols in conjunction with a mutation tag sequence primer on DNAs prepared from a population of plants in which Mutator transposons or some other mutation-causing DNA element has been introduced (see Bensen, supra). The amplification of a specific DNA fragment with these primers indicates the insertion of the mutation tag element in or near the plant gene encoding the instant polypeptides. Alternatively, the instant nucleic acid fragment may be used as a hybridization probe against PCR amplification products generated from the mutation population using the mutation tag sequence primer in conjunction with an arbitrary genomic site primer, such as that for a restriction enzyme site-anchored synthetic adaptor. With either method, a plant containing a mutation in the endogenous gene encoding the instant polypeptides can be identified and obtained. This mutant plant can then be used to determine or confirm the natural function of the instant polypeptides disclosed herein.
EXAMPLES
The present invention is further defined in the following Examples, in which all parts and percentages are by weight and degrees are Celsius, unless otherwise stated. It should be understood that these Examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are given by way of illustration only.
EXAMPLE 1
Composition of cDNA Libraries; Isolation and Sequencing of cDNA Clones
cDNA libraries representing mRNAs from various corn, rice, soybean, and wheat tissues were prepared. The characteristics of the libraries are described below.
TABLE 2
cDNA Libraries from Corn, Rice, Soybean, and Wheat
Library Tissue Clone
cen3n Corn Endosperm 20 Days After Pollination* cen3n.pk0157.e12
cholc Corn Embryo 20 Days After Pollination cho1c.pk004.f12
cr1n Corn Root From 7 Day Old Seedlings* cr1n.pk0095.g3
csi1 Corn Silk csi1.pk0041.f11
p0004 Corn Immature Ear p0004.cb1hh74r
p0006 Corn Young Shoot p0006.cbyvo28r
p0012 Corn Middle 3/4 of the 3rd Leaf Blade and Mid Rib From Green Leaves Treated with Jasmonic Acid (1 mg/ml in 0.02% Tween 20) for 24 Hours Before Collection p0012.cg1ac07r
rlr6 Rice Leaf 15 Days After Germination, 6 Hours After Infection of Strain Magaporthe grisea 4360-R-62 (AVR2-YAMO); Resistant rlr6.pk0073.d5
ses2w Soybean Embryogenic Suspension Two Weeks After Subculture ses2w.pk0029.e5
sgc3c Soybean Cotyledon 14-21 Days After Germination (Starting to Turn Yellow) sgc3c.pk001.d16
sl1 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings sl1.pk0021.a6
sl1 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings sl1.pk0036.a5
sl1 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings sl1.pk152.i19
sl2 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings Treated With 2.5 ppm chlorimuron sl2.pk0039.d4
sl2 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings Treated With 2.5 ppm chlorimuron sl2.pk0111.c9
sl2 Soybean Two-Week-Old Developing Seedlings Treated With 2.5 ppm chlorimuron sl2.pk124.p17
sml1c Soybean Mature Leaf sml1c.pk001.c15
sml1c Soybean Mature Leaf sml1c.pk005.a24
srl Soybean Root sr1.pk0008.d1
srm Soybean Root Meristem srm.pk0014.f8
wlm12 Wheat Seedlings 12 Hours After Inoculation WithErysiphe graminis f. sp tritici wlm12.pk0003.d11
wlm24 Wheat Seedlings 24 Hours After Inoculation WithErysiphe graminis f. sp tritici wlm24.pk0014.d7
wr1 Wheat Root From 7 Day Old Seedling wr1.pk0084.a4
*These libraries were normalized essentially as described in U.S. Patent No. 5,482,845.
cDNA libraries may be prepared by any one of many methods available. For example, the cDNAs may be introduced into plasmid vectors by first preparing the cDNA libraries in Uni-ZAP™ XR vectors according to the manufacturer's protocol (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). The Uni-ZAP™ XR libraries are converted into plasmid libraries according to the protocol provided by Stratagene. Upon conversion, cDNA inserts will be contained in the plasmid vector pBluescript. In addition, the cDNAs may be introduced directly into precut Bluescript II SK( ) vectors (Stratagene) using T4 DNA ligase (New England Biolabs), followed by transfection into DH10B cells according to the manufacturer's protocol (GIBCO BRL Products). Once the cDNA inserts are in plasmid vectors, plasmid DNAs are prepared from randomly picked bacterial colonies containing recombinant pBluescript plasmids, or the insert cDNA sequences are amplified via polymerase chain reaction using primers specific for vector sequences flanking the inserted cDNA sequences. Amplified insert DNAs or plasmid DNAs are sequenced in dye-primer sequencing reactions to generate partial cDNA sequences (expressed sequence tags or "ESTs"; see Adams et al., (1991) Science 252:1651-1656). The resulting ESTs are analyzed using a Perkin Elmer Model 377 fluorescent sequencer.
EXAMPLE 2
Identification of cDNA Clones
cDNA clones encoding isopentenyl diphosphate biosynthetic enzymes were identified by conducting BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; see also www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/) searches for similarity to sequences contained in the BLAST "nr" database (comprising all non-redundant GenBank CDS translations, sequences derived from the 3-dimensional structure Brookhaven Protein Data Bank, the last major release of the SWISS-PROT protein sequence database, EMBL, and DDBJ databases). The cDNA sequences obtained in Example 1 were analyzed for similarity to all publicly available DNA sequences contained in the "nr" database using the BLASTN algorithm provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The DNA sequences were translated in all reading frames and compared for similarity to all publicly available protein sequences contained in the "nr" database using the BLASTX algorithm (Gish and States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) provided by the NCBI. For convenience, the P-value (probability) of observing a match of a cDNA sequence to a sequence contained in the searched databases merely by chance as calculated by BLAST are reported herein as "pLog" values, which represent the negative of the logarithm of the reported P-value. Accordingly, the greater the pLog value, the greater the likelihood that the cDNA sequence and the BLAST "hit" represent homologous proteins.
EXAMPLE 3
Characterization of cDNA Clones Encoding 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase
The BLASTX search using the EST sequences from clones listed in Table 3 revealed similarity of the polypeptides encoded by the cDNAs to 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from Synechocystis PCC6803 and Escherichia coli (NCBI General Identifier Nos. 1001556 and 3434984, respectively). Shown in Table 3 are the BLAST results for individual ESTs ("EST"), contigs assembled from two or more ESTs ("Contig"), or sequences encoding the entire protein derived from the entire cDNA inserts comprising the indicated cDNA clones ("FIS"), a contig, or an FIS and PCR ("CGS"):
TABLE 3
BLAST Results for Sequences Encoding Polypeptides Homologous to 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase
BLAST pLog Score
Clone Status 1001556 3434984
Contig of: Contig 14.40 10.70
p0004.cb1hh74r
p0012.cglac07r
p0006.cbyvo28r
Contig of: Contig 111.0 59.52
cen3n.pk0157.e12
cr1n.pk0095.g3
cho1c.pk004.f12
csi1.pk0041.f11
rlr6.pk0073.d5 CGS 164.0 94.0
Contig of: CGS 154.0 85.50
sml1c.pk001.c15
sml1c.pk005.a24
sl1.pk0021.a6
sl2.pk124.p17
sl1.pk0036.a5
sl2.pk0111.c9
sl1.pk152.i19
sl2.pk0039.d4
Contig of: Contig 64.40 32.40
sr1.pk0008.d1
sr1.pk0007.c11
srm.pk0014.f8
Contig of: Contig 12.70 9.30
wlm12.pk0003.d11
wr1.pk0084.a4
wlm24.pk0014.d7 EST 24.70 10.70
Further sequencing of some of the above clones yielded new information. The BLASTX search using the nucleotide sequences from clones listed in Table 4 revealed similarity of the polypeptides encoded by the cDNAs to 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from Arabidopsis thaliana, Mentha x piperita, andSynechocystis sp. (NCBI General Identifier Nos. 4886307, 4581856, and 2496789, respectively). Shown in Table 4 are the BLAST results for the sequences of the entire cDNA inserts comprising the indicated cDNA clones ("FIS"), contigs assembled from an FIS and an EST ("Contig*"), or sequences encoding the entire protein derived from an FIS, or an FIS and PCR ("CGS"):
TABLE 4
BLAST Results for Sequences Encoding Polypeptides Homologous to 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase
BLAST pLog Score
Clone Status 4886307 4581856 2496789
p0004.cb1hh74r CGS >254.00 >254.00 >254.00
Contig of CGS >254.00 >25.4.00 >254.00
ses2w.pk0029.e5
sgc3c.pk001.d16
sr1.pk0008.d1:fis
wlm12.pk0003.d11:fis FIS 145.00 145.00 145.00
Figure 1 presents an alignment of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs:6, 8, 16, 18, and 20 and the Arabidopsis thaliana and Mentha x piperita sequences (SEQ ID NO:21 and SEQ ID NO:22). The data in Table 5 represents a calculation of the percent identity of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs:6, 8, 16, 18, and 20 and the Arabidopsis thaliana and Mentha x piperita sequences (SEQ ID NO:21 and SEQ ID NO:22).
TABLE 5
Percent Identity of Amino Acid Sequences Deduced From the Nucleotide Sequences of cDNA Clones Encoding Polypeptides Homologous to 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase
Percent Identity to
SEQ ID NO. 4886307 4581856
16 90.9 73.8
6 91.6 73.0
18 88.4 74.1
8 77.6 66.1
20 89.7 72.2
Sequence alignments and percent identity calculations were performed using the Megalign program of the LASERGENB bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Multiple alignment of the sequences was performed using the Clustal method of alignment (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-1S3) with the default parameter (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Default parameters for pairwise alignments using the Clustal method were KTUPLB I, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 and DIAGONALS SAVBD=5. Sequence alignments and BLAST scores and probabilities indicate that the nucleic acid fragments comprising the instant cDNA clones encode one corn, one rice, one wheat, and two soybean 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase. These sequences represent the first corn, rice, soybean, and wheat sequences encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase.
EXAMPLE 4
Expression of Chimeric Genes in Monocot Cells
A chimeric gene comprising a cDNA encoding the instant polypeptides in sense orientation with respect to the maize 27 kD zein promoter that is located 5' to the cDNA fragment, and the 10 kD zein 3' end that is located 3' to the cDNA fragment, can be constructed. The cDNA fragment of this gene may be generated by polymerase chain reaction (PCR) of the cDNA clone using appropriate oligonucleotide primers. Cloning sites (NcoI or SmaI) can be incorporated into the oligonucleotides to provide proper orientation of the DNA fragment when inserted into the digested vector pML103 as described below. Amplification is then performed in a standard PCR. The amplified DNA is then digested with restriction enzymes NcoI and SmaI and fractionated on an agarose gel. The appropriate band can be isolated from the gel and combined with a 4.9 kb NcoI-SmaI fragment of the plasmid pML103. Plasmid pML103 has been deposited under the terms of the Budapest Treaty at ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), and bears accession number ATCC 97366. The DNA segment from pML103 contains a 1.05 kb SaII-NcoI promoter fragment of the maize 27 kD zein gene and a 0.96 kb SmaI-SaII fragment from the 3' end of the maize 10 kD zein gene in the vector pGem9Zf( ) (Promega). Vector and insert DNA can be ligated at 15°C overnight, essentially as described (Maniatis). The ligated DNA may then be used to transform E. coli XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 Blue™; Stratagene). Bacterial transformants can be screened by restriction enzyme digestion of plasmid DNA and limited nucleotide sequence analysis using the dideoxy chain termination method (Sequenase™ DNA Sequencing Kit; U.S. Biochemical). The resulting plasmid construct would comprise a chimeric gene encoding, in the 5' to 3' direction, the maize 27 kD zein promoter, a cDNA fragment encoding the instant polypeptides, and the 10 kD zein 3' region.
The chimeric gene described above can then be introduced into corn cells by the following procedure. Immature corn embryos can be dissected from developing caryopses derived from crosses of the inbred corn lines H99 and LH132. The embryos are isolated 10 to 11 days after pollination when they are 1.0 to 1.5 mm long. The embryos are then placed with the axis-side facing down and in contact with agarose-solidified N6 medium (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659-668). The embryos are kept in the dark at 27°C. Friable embryogenic callus consisting of undifferentiated masses of cells with somatic proembryoids and embryoids borne on suspensor structures proliferates from the scutellum of these immature embryos. The embryogenic callus isolated from the primary explant can be cultured on N6 medium and sub-cultured on this medium every 2 to 3 weeks.
The plasmid, p35S/Ac (obtained from Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Germany) may be used in transformation experiments in order to provide for a selectable marker. This plasmid contains the Pat gene (see European Patent Publication 0 242 236) which encodes phosphinothricin acetyl transferase (PAT). The enzyme PAT confers resistance to herbicidal glutamine synthetase inhibitors such as phosphinothricin. The pat gene in p35S/Ac is under the control of the 35S promoter from Cauliflower Mosaic Virus (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) and the 3' region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of the Ti plasmid of grobacterium tumefaciens.
The particle bombardment method (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) may be used to transfer genes to the callus culture cells. According to this method, gold particles (1 µm in diameter) are coated with DNA using the following technique. Ten µg of plasmid DNAs are added to 50 µL of a suspension of gold particles (60 mg per mL). Calcium chloride (50 µL of a 2.5 M solution) and spermidine free base (20 µL of a 1.0 M solution) are added to the particles. The suspension is vortexed during the addition of these solutions. After 10 minutes, the tubes are briefly centrifuged (5 sec at 15,000 rpm) and the supernatant removed. The particles are resuspended in 200 µL of absolute ethanol, centrifuged again and the supernatant removed. The ethanol rinse is performed again and the particles resuspended in a final volume of 30 µL of ethanol. An aliquot (5 µL) of the DNA-coated gold particles can be placed in the center of a Kapton™ flying disc (Bio-Rad Labs). The particles are then accelerated into the corn tissue with a Biolistic™ PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA), using a helium pressure of 1000 psi, a gap distance of 0.5 cm and a flying distance of 1.0 cm.
For bombardment, the embryogenic tissue is placed on filter paper over agarose-solidified N6 medium. The tissue is arranged as a thin lawn and covered a circular area of about 5 cm in diameter. The petri dish containing the tissue can be placed in the chamber of the PDS-1000/He approxim
Traduzione - Italiano Titolo: 1-DESOSSI-D-XILULOSIO 5-FOSFATO REDUTTOISOMERASI DI PIANTA
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Descrizione
Questa domanda di brevetto rivendica il beneficio della domanda di brevetto provvisoria statunitense No. 60 / 110.865, depositata il 4 dicembre 1998.
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione risiede nel ramo della biologia molecolare delle piante. Più nello specifico, questa invenzione riguarda frammenti di acido nucleico codificanti per 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi in piante e semi.
SFONDO DELL'INVENZIONE
Gli isoprenoidi comprendono la più grande famiglia di prodotti naturali, inclusi numerosi composti secondari che svolgono ruoli funzionali differenti nelle piante come ormoni, pigmenti fotosintetici, trasportatori di elettroni, e componenti strutturali di membrane. L'unità fondamentale nella biosintesi degli isoprenoidi, l'isopentenil difosfato (IPP), viene normalmente sintetizzata dalla condensazione di acetil CoA attraverso la via del mevalonato. In numerosi organismi, compresi diversi batteri, alghe e plastidi vegetali, l'IPP viene sintetizzato da una via indipendente dal mevalonato. Lo stadio iniziale di questa via è la condensazione di piruvato e gliceraldeide 3-fosfato per formare 1-desossi-D-xilulosio 4-fosfato. Nello stadio obbligato che conduce alla formazione di IPP, la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi catalizza, in un unico passaggio, un riarrangiamento intramolecolare e la riduzione di 1-deosossi-D-xilulosio 4-fosfato per formare 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato.
L'enzima 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi di E. coli è stato identificato solo di recente. Un confronto tra la sequenza di amminoacidi della 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi di E. coli con quelle di Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyroli, Mycobacterium tuberculosis e Synechocystis sp. PCC6803 ha mostrato l'esistenza di una scarsa conservazione tra queste sequenze (Takahashi et al. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 95:9879-9884).
RIEPILOGO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda frammenti isolati di acido nucleico codificanti per enzimi biosintetici di isopentenil difosfato. Nello specifico, questa invenzione riguarda un frammento isolato di acido nucleico codificante per una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi. Inoltre, questa invenzione riguarda un frammento di acido nucleico che è complementare al frammento di acido nucleico codificante per una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi.
La domanda di brevetto divulga una cassetta di espressione comprendente un polinucleotide isolato della presente invenzione, operativamente legato ad un promotore.
Divulga anche un metodo per la selezione positiva di una cellula trasformata, comprendente i passaggi di:
(a) trasformare una cellula ospite con il gene chimerico della presente invenzione o con una cassetta di espressione della presente invenzione; e
(b) far crescere la cellula ospite trasformata sotto condizioni che permettono l'espressione del polinucleotide in una quantità sufficiente a complementare un mutante null per la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, fornendo così mezzi di selezione positiva.
La presente invenzione riguarda un frammento isolato di acido nucleico comprendente: (a) un frammento di acido nucleico codificante per una sequenza di amminoacidi selezionata da SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8; (b) un frammento di acido nucleico costituito da una sequenza selezionata da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7; (c) un frammento di acido nucleico che codifica per un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi e che ibrida con (b), e che rimane ibridato con (b) sotto condizioni di lavaggio di SSC 0,1X ed SDS 0,1 % a 65°C; oppure (d) un frammento di acido nucleico che ha una sequenza complementare a (a), (b) o (c).
È preferito che i frammenti isolati di acido nucleico dell'invenzione rivendicata siano costituiti da una sequenza di acido nucleico selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 5 e 7, che codifica per il polipeptide selezionato dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 6 e 8.
La presente invenzione riguarda un gene chimerico comprendente un frammento isolato di acido nucleico della presente invenzione, operativamente legato a sequenze regolatorie adatte.
La presente invenzione riguarda una cellula ospite isolata comprendente un gene chimerico della presente invenzione. La cellula ospite può essere eucariotica, come una cellula di lievito o pianta, oppure procariotica, come una cellula batterica.
È inoltre divulgato un processo per produrre una cellula ospite isolata comprendente un gene chimerico della presente invenzione o un polinucleotide isolato della presente invenzione, il processo comprendendo il passaggio di trasformare o trasfettare, con un gene chimerico o con un polinucleotide isolato della presente invenzione, una cellula ospite compatibile isolata.
È anche divulgato un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi di almeno 200 amminoacidi comprendente un'omologia di almeno 93 %, più preferibilmente di almeno 95 % circa, e più preferibilmente di almeno 98 % circa, in base al metodo di allineamento Clustal, rispetto ad un polipeptide selezionato dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 6 e 8.
È inoltre divulgato un metodo per selezionare un polinucleotide isolato che influenza il livello di espressione di un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi in una cellula ospite, il metodo comprendendo i passaggi di: (a) costruire un polinucleotide isolato della presente invenzione o un gene chimerico isolato della presente invenzione; (b) introdurre il polinucleotide isolato o il gene chimerico isolato in una cellula ospite; (c) misurare il livello di un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi nella cellula ospite contenente il polinucleotide isolato; e (d) confrontare il livello di un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi nella cellula ospite contenente il polinucleotide isolato, con il livello di un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi in una cellula ospite che non contiene il polinucleotide isolato.
È anche divulgato un metodo per ottenere un frammento di acido nucleico codificante per una porzione sostanziale di un gene di polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, comprendente i passaggi di: sintetizzare un primer oligonucleotidico comprendente una sequenza nucleotidica di almeno uno di 40 (preferibilmente almeno uno di 30) nucleotidi contigui, derivati da una sequenza nucleotidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, e il complemento di tali sequenze nucleotidiche; e amplificare un frammento di acido nucleico (preferibilmente un cDNA inserito in un vettore di clonazione) utilizzando il primer oligonucleotidico. Il frammento amplificato di acido nucleico codificherà preferibilmente per una porzione di una sequenza di amminoacidi di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi.
È inoltre divulgato un metodo per ottenere un frammento di acido nucleico codificante per la totalità o per una porzione sostanziale della sequenza di amminoacidi codificante per un polipeptide di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, comprendente i passaggi di: sondare una libreria di cDNA o genomica con un polinucleotide isolato della presente invenzione; identificare un clone di DNA che ibrida con un polinucleotide isolato della presente invenzione; isolare il clone identificato di DNA; e sequenziare il frammento di cDNA o genomico che comprende il clone isolato di DNA.
È anche divulgato un metodo per valutare almeno un composto per la sua capacità di inibire l'attività di una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, il metodo comprendendo i passaggi di: (a) trasformare una cellula ospite con un gene chimerico comprendente un frammento di acido nucleico codificante per una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, operativamente legato a sequenze regolatorie adatte; (b) far crescere la cellula ospite trasformata sotto condizioni adatte per l'espressione del gene chimerico, in cui l'espressione del gene chimerico comporta la produzione di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi nella cellula ospite trasformata; (c) opzionalmente purificare la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi espressa dalla cellula ospite trasformata; (d) trattare la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi con un composto da valutare; e (e) confrontare l'attività della 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi che è stata trattata con un composto di prova, con l'attività di una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi non trattata, così da selezionare composti con un potenziale di attività inibitoria.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI E DESCRIZIONI DELLE SEQUENZE
L'invenzione può essere compresa in maniera più esaustiva dalla seguente descrizione dettagliata, nonché dal disegno e dall'elenco delle sequenze in allegato che costituiscono parte di questa domanda di brevetto.
La Figura 1 mostra un confronto tra le sequenze di amminoacidi della 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi del clone di granturco p0004.cb1hh74r (SEQ ID NO:16), del clone di riso rlr6.pk0073.d5 (SEQ ID NO:6), di un contig di soia assemblato dai cloni smllc.pk001.c15, sml1c.pk005.a24, sl1.pk0021.a6, sl2.pk124.p17, sl1.pk0036.a5, sl2.pk0111.c9, sl1.pk152.i19 e sl2.pk0039.d4 (SEQ ID NO:8), di un contig di soia assemblato dai cloni ses2w.pk0029.e5, sgc3c.pk001.d16 e sr1.pk0008.d1:fis (SEQ ID NO:18), di un clone di frumento wlm12.pk0003.d11:fis (SEQ ID NO:20), di Arabidopsis thaliana (identificatore generale NCBI No. 4886307; SEQ ID NO:21), e di Mentha x piperita (identificatore generale NCBI No. 4581856; SEQ ID NO:22). Gli amminoacidi conservati tra tutte le sequenze sono indicati da un asterisco (*) sulla riga superiore; i trattini vengono usati dal programma per ottimizzare l'allineamento delle sequenze.
La Tabella 1 elenca i polipeptidi qui descritti, la designazione dei cloni di cDNA che comprendono i frammenti di acido nucleico codificanti per polipeptidi che rappresentano la totalità o una parte sostanziale di questi polipeptidi, e il corrispondente identificatore (SEQ ID NO:) come usato nell'elenco delle sequenze allegato. Le descrizioni delle sequenze e l'elenco delle sequenze in allegato alla presente sono conformi alle norme che regolano la divulgazione delle sequenze di nucleotidi e / o amminoacidi nelle domande di brevetto, come delineate in 37 C.F.R. §1.821-1.825.
TABELLA 1
Enzimi biosintetici di isopentenil difosfato
SEQ ID NO:
Proteina Designazione clone (Nucleotide) (Amminoacido)
1-desossi-D-xilulosio di granturco Contig di: 1 2
5-fosfato reduttoisomerasi p0004.cb1hh74r
p0012.cg1ac07r
p0006.cbyvo28r
1-desossi-D-xilulosio di granturco Contig di: 3 4
5-fosfato reduttoisomerasi cen3n.pk0157.e12
cr1n.pk0095.g3
cho1c.pk004.f12
csi1.pk0041.f11
1-desossi-d-xilulosio 5-fosfato
reduttoisomerasi di riso rlr6.pk0073.d5 5 6
1-desossi-D-xilulosio di soia Contig di: 7 8
5-fosfato reduttoisomerasi sml1c.pk001.c15
sml1c.pk005.a24
sl1.pk0021.a6
sl2.pk124.p17
sl1.pk0036.a5.
sl2.pk0111.c9
sl1.pk152.i19
sl2.pk0039.d4
1-desossi-D-xilulosio di soia Contig di: 9 10
5-fosfato reduttoisomerasi sr1.pk0008.d1
sr1.pk0007.c11
srm.pk0014.f8
1-desossi-D-xilulosio di frumento Contig di: 11 12
5-fosfato reduttoisomerasi wlm12.pk0003.d11
wr1.pk0084.a4
1-desossi-d-xilulosio 5-fosfato
reduttoisomerasi di frumento wlm24.pk0014.d7 13 14
1-desossi-d-xilulosio 5-fosfato
reduttoisomerasi di granturco p0004.cb1hh74r 15 16
1-desossi-D-xilulosio di soia Contig di: 17 18
5-fosfato reduttoisomerasi ses2w.pk0029.e5
sgc3c.pk001.d16
sr1.pk0008.d1:fis
1-desossi-d-xilulosio 5-fosfato
reduttoisomerasi di frumento wlm12.pk0003.d11:fis 19 20
L'elenco delle sequenze contiene il codice monolettera per i caratteri delle sequenze nucleotidiche, e i codici a tre lettere per gli amminoacidi, come definiti in conformità agli standard IUPAC-IUBMB descritti in Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985), e in Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984). I simboli e il formato adottati per i dati relativi alle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi sono conformi alle norme delineate in 37 C.F.R. §1.822.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Nel contesto di questa divulgazione verrà adottata una pluralità di termini. Nel presente contesto, un "polinucleotide" è una sequenza nucleotidica, come un frammento di acido nucleico. Un polinucleotide può essere un polimero di RNA o DNA, a filamento singolo o doppio, opzionalmente contenente basi nucleotidiche sintetiche, non naturali o alterate. Un polinucleotide nella forma di un polimero di DNA può essere costituito da uno o più segmenti di cDNA, DNA genomico, DNA sintetico, o loro miscele.
Nel presente contesto, un "contig" indica una sequenza nucleotidica che viene assemblata da due o più sequenze nucleotidiche costituenti che condividono regioni comuni o sovrapposte di omologia di sequenza. Ad esempio, le sequenze nucleotidiche di due o più frammenti di acido nucleico possono essere confrontate e allineate allo scopo di identificare sequenze comuni o sovrapposte. Laddove esistono sequenze comuni o sovrapposte tra due o più frammenti di acido nucleico, le sequenze (e quindi i loro frammenti di acido nucleico corrispondenti) possono essere assemblate in una singola sequenza nucleotidica contigua.
Nel presente contesto, con "sostanzialmente simili" si intendono frammenti di acido nucleico in cui cambiamenti in una o più basi nucleotidiche portano alla sostituzione di uno o più amminoacidi, senza tuttavia incidere sulle proprietà funzionali del polipeptide codificato dalla sequenza nucleotidica. Con "sostanzialmente simili" si intendono anche frammenti di acido nucleico in cui cambiamenti in una o più basi nucleotidiche non incidono sulla capacità del frammento di acido nucleico di mediare l'alterazione dell'espressione genica mediante silenziamento genico attraverso, ad esempio, la tecnologica antisenso o di co-soppressione. Con "sostanzialmente simili" si intendono inoltre modifiche dei frammenti di acido nucleico della presente invenzione, come la delezione o l'inserimento di uno o più nucleotidi, che non incidono sostanzialmente sulle proprietà funzionali del trascritto risultante in merito alla capacità di mediare un silenziamento o un'alterazione genica delle proprietà funzionali della molecola proteica risultante.
Frammenti di acido nucleico sostanzialmente simili possono essere selezionati mediante screening di frammenti di acido nucleico che rappresentano subframmenti o modifiche dei frammenti di acido nucleico della presente invenzione, in cui uno o più nucleotidi vengono sostituiti, deleti e / o inseriti in base alla loro capacità di influenzare il livello del polipeptide, codificato dal frammento di acido nucleico non modificato, in una pianta o in una cellula di pianta. È ad esempio possibile costruire, e introdurre in una pianta o in una cellula di pianta, un frammento di acido nucleico sostanzialmente simile che rappresenta almeno uno di 30 nucleotidi contigui derivati dal presente frammento di acido nucleico. Il livello del polipeptide codificato dal frammento di acido nucleico non modificato presente in una pianta o cellula di pianta esposta al frammento di acido nucleico sostanzialmente simile, può quindi essere confrontato con il livello del polipeptide in una pianta o cellula di pianta non esposta al frammento di acido nucleico sostanzialmente simile.
Ad esempio, nel ramo è ben nota la possibilità di ottenere la soppressione antisenso e la co-soppressione dell'espressione di un gene, utilizzando frammenti di acido nucleico che rappresentano meno dell'intera regione codificante di un gene, e usando frammenti di acido che non condividono un'identità di sequenza del 100 % con il gene da sopprimere. Nel ramo sono inoltre ben note alterazioni di un frammento di acido nucleico che portano alla produzione di un amminoacido chimicamente equivalente in un dato sito, senza tuttavia incidere sulle proprietà funzionali del polipeptide codificato. Un codone per l'amminoacido alanina, un amminoacido idrofobo, può così essere sostituito con un codone codificante per un altro residuo meno idrofobo, come glicina, o per un residuo più idrofobo, come valina, leucina o isoleucina. In modo simile, ci si può anche attendere che modifiche in grado di causare la sostituzione di un singolo residuo di carica negativa per un altro, come acido aspartico per acido glutammico, o di un singolo residuo di carica positiva per un altro, come lisina per arginina, diano luogo ad un prodotto funzionalmente equivalente. Ci si attenderebbe inoltre che sostituzioni nucleotidiche in grado di causare un'alterazione delle porzioni N-terminale e C-terminale della molecola polipeptidica non alterino l'attività del polipeptide. Ciascuna delle modifiche proposte rientra ampiamente nelle competenze di routine nel ramo, così come la determinazione dell'attività biologica trattenuta dai prodotti codificati. Di conseguenza, è possibile utilizzare un polinucleotide isolato comprendente una sequenza nucleotidica di almeno uno di 60 (preferibilmente almeno uno di 40, con preferenza assoluta almeno uno di 30) nucleotidi contigui derivati da una sequenza nucleotidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, e il complemento di tali sequenze nucleotidiche, in metodi per selezionare un polinucleotide isolato che influenza l'espressione di un polipeptide in una cellula di pianta. Un metodo per selezionare un polinucleotide isolato che influenza il livello di espressione di un polipeptide, come una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, in una cellula ospite (eucariotica, come una pianta o un lievito, procariotica, come un batterio, o virale) può comprendere i passaggi di: costruire un polinucleotide isolato della presente invenzione o un gene chimerico isolato della presente invenzione; introdurre il polinucleotide isolato o il gene chimerico isolato in una cellula ospite; misurare il livello di un polipeptide nella cellula ospite contenente il polinucleotide isolato; e confrontare il livello di un polipeptide nella cellula ospite contenente il polinucleotide isolato, con il livello di un polipeptide in una cellula ospite che non contiene il polinucleotide isolato.
Inoltre, frammenti di acido nucleico sostanzialmente simili possono anche essere caratterizzati in base alla loro capacità di ibridazione. Le stime di tale omologia sono fornite da un'ibridazione DNA-DNA o DNA-RNA sotto condizioni di stringenza, come ben compreso dagli esperti del ramo (Hames & Higgins, edd. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.). Le condizioni di stringenza possono essere regolate in modo da isolare per screening frammenti da moderatamente simili, come sequenze omologhe di organismi correlati alla lontana, ad altamente simili, come geni che duplicano enzimi funzionali di organismi strettamente correlati. I lavaggi di post-ibridazione determinano le condizioni di stringenza. Un gruppo di condizioni preferite utilizza una serie di lavaggi che iniziano con SSC 6X, SDS 0,5 %, a temperatura ambiente per 15 minuti, ripetuti quindi con SSC 2X, SDS 0,5 %, a 45°C per 30 minuti, e ripetuti quindi due volte con SSC 0,2X, SDS 0,5 %, a 50°C per 30 minuti. Un gruppo maggiormente preferito di condizioni di stringenza utilizza temperature più alte in cui i lavaggi sono identici a quelli di sopra, eccetto per il fatto che la temperatura dei due lavaggi finali di 30 minuti in SSC 0,2X, SDS 0,5 % è stata aumentata a 60°C. Un altro gruppo preferito di condizioni altamente stringenti utilizza due lavaggi finali in SSC 0,1X, SDS 0,1 % a 65°C.
I frammenti di acido nucleico sostanzialmente simili possono anche essere caratterizzati in base all'identità percentuale delle sequenze di amminoacidi che essi codificano rispetto alle sequenze di amminoacidi qui divulgate, come determinato con algoritmi comunemente usati da coloro addentro in questo ramo. Frammenti di acido nucleico adatti codificano per polipeptidi che sono identici per almeno il 70 % circa, o identici per almeno l'80 % circa, alle sequenze di amminoacidi qui riportate. Sono divulgati frammenti di acido nucleico che codificano per sequenze di amminoacidi che sono identiche per almeno l'85 % circa alle sequenze di amminoacidi qui riportate. Altri frammenti di acido nucleico codificano per sequenze di amminoacidi che sono identiche per almeno il 90 % circa alle sequenze di amminoacidi qui riportate. Altri sono frammenti di acido nucleico che codificano per sequenze di amminoacidi che sono identiche per almeno il 93 % circa alle sequenze di amminoacidi qui riportate. I frammenti di acido nucleico adatti non solo hanno le suddette omologie, ma codificano tipicamente per un polipeptide avente almeno 50 amminoacidi circa, preferibilmente almeno 100 amminoacidi circa, più preferibilmente almeno 150 amminoacidi circa, ancora più preferibilmente almeno 200 amminoacidi circa, e con preferenza assoluta almeno 250 amminoacidi circa. Gli allineamenti di sequenza e i calcoli dell'identità percentuale sono stati condotti usando il programma Megalign del pacchetto di calcolo bioinformatico LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). L'allineamento multiplo delle sequenze è stato eseguito usando il metodo di allineamento Clustal (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con i parametri predefiniti (PENALITÀ INTERVALLO=10, PENALITÀ DI LUNGHEZZA INTERVALLO=10). Usando il metodo Clustal, i parametri predefiniti per gli allineamenti a coppie erano K-TUPLA=1, PENALITÀ INTERVALLO=3, FINESTRA=5, e DIAGONALI SALVATE=5.
Una "porzione sostanziale" di una sequenza di amminoacidi o di nucleotidi comprende una sequenza di amminoacidi o di nucleotidi che è sufficiente a fornire un'identificazione putativa della proteina o del gene che la sequenza di amminoacidi o di nucleotidi comprende. Le sequenze di amminoacidi e di nucleotidi possono essere valutate o manualmente da un esperto del ramo, o avvalendosi di strumenti computerizzati di confronto e identificazione di sequenze che utilizzano algoritmi come BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al.(1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; vedere anche www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST / ). In generale, perché una sequenza polipeptidica o una sequenza di acido nucleico venga putativamente identificata come omologa ad una proteina o gene noto, è necessaria una sequenza di dieci o più amminoacidi contigui, oppure di trenta o più nucleotidi contigui. Inoltre, per quanto concerne le sequenze nucleotidiche, è possibile utilizzare sonde oligonucleotidiche gene-specifiche comprendenti 30 o più nucleotidi contigui in metodi sequenza-dipendenti di identificazione (ad esempio un'ibridazione Southern) e isolamento di geni (ad esempio un'ibridazione in situ di colonie batteriche o di placche batteriofagiche). È inoltre possibile usare oligonucleotidi corti, di 12 o più nucleotidi, come primer di amplificazione in una PCR allo scopo di ottenere un particolare frammento di acido nucleico comprendente i primer. Pertanto, una "porzione sostanziale" di una sequenza nucleotidica comprende una sequenza nucleotidica che permetterà l'identificazione e / o l'isolamento specifico di un frammento di acido nucleico comprendente la sequenza. La presente descrizione insegna sequenze di amminoacidi e di nucleotidi che codificano per polipeptidi comprendenti uno o più particolari proteine di pianta. Il tecnico esperto, avendo il beneficio delle sequenze qui riportate, può ora adoperare la totalità o una parte sostanziale delle sequenze divulgate per scopi noti agli esperti del ramo.
Il termine "degenerazione dei codoni" indica la divergenza nel codice genetico che permette una variazione della sequenza nucleotidica, senza incidere sulla sequenza di amminoacidi di un polipeptide codificato. Pertanto, la presente invenzione riguarda qualsiasi frammento di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica che codifica per la totalità o per una parte sostanziale delle sequenze di amminoacidi qui delineate. Il tecnico esperto è ben consapevole della "preferenza di codone" mostrata da una specifica cellula ospite nell'utilizzo dei codoni nucleotidici per specificare un dato amminoacido. Pertanto, durante la sintesi di un frammento di acido nucleico volta ad ottenere un'espressione migliorata in una cellula ospite, è desiderabile progettare il frammento di acido nucleico affinché la sua frequenza d'uso dei codoni si avvicini alla frequenza d'uso preferita dei codoni nella cellula ospite.
Avvalendosi di procedure note agli esperti del ramo, è possibile assemblare "frammenti sintetici di acido nucleico" da blocchi oligonucleotidici di costruzione che vengono sintetizzati con mezzi chimici. Questi blocchi di costruzione vengono legati e associati, formando frammenti di acido nucleico più grandi che possono poi essere assemblati tramite enzimi, allo scopo di costruire l'intero frammento di acido nucleico desiderato. Il termine "sintetizzato con mezzi chimici", riferito ad un frammento di acido nucleico, intende che i nucleotidi costituenti sono stati assemblati in vitro. La sintesi chimica manuale di frammenti di acido nucleico può essere condotta ricorrendo a procedure ampiamente consolidate, oppure è possibile eseguire una sintesi automatizzata utilizzando una di numerose macchine disponibili in commercio. Pertanto, i frammenti di acido nucleico possono essere adattati per un'espressione genica ottimale, basandosi su un'ottimizzazione della sequenza nucleotidica tale da riflettere la preferenza di codone nella cellula ospite. Il tecnico esperto è conscio della probabilità di successo di un'espressione genica se l'uso dei codoni viene spinto verso quei codoni favoriti dall'ospite. Quando sono disponibili informazioni di sequenza, la determinazione dei codoni preferiti può essere basata su un'indagine di geni derivati dalla cellula ospite.
In termine "gene" indica un frammento di acido nucleico che esprime una proteina specifica, incluse le sequenze regolatorie che precedono (sequenze non codificanti in 5') e che seguono (sequenze non codificanti in 3') la sequenza codificante. Un "gene nativo" indica un gene come esistente in natura, comprensivo delle sue sequenze regolatorie. Un "gene chimerico" indica qualsiasi gene che non è un gene nativo, incluse sequenze regolatorie e sequenze codificanti che non si trovano insieme in natura. Un gene chimerico può dunque comprendere sequenze regolatorie e sequenze codificanti derivate da fonti differenti, o sequenze regolatorie e sequenze codificanti derivate dalla stessa fonte, ma disposte in maniera differente rispetto a quanto riscontrabile in natura. Un "gene endogeno" indica un gene nativo nella sua posizione naturale all'interno del genoma di un organismo. Un gene "estraneo" indica un gene che non si trova normalmente nell'organismo ospite, ma che viene introdotto nell'organismo ospite mediante trasferimento genico. I geni estranei possono comprendere geni nativi inseriti in un organismo non nativo, oppure geni chimerici. Un "transgene" è un gene che è stato introdotto nel genoma attraverso una procedura di trasformazione.
Una "sequenza codificante" indica una sequenza nucleotidica che codifica per una specifica sequenza di amminoacidi. Le "sequenze regolatorie" indicano sequenze nucleotidiche situate a monte (sequenze non codificanti in 5'), all'interno, o a valle (sequenze non codificanti in 3') di una sequenza codificante, e che influenzano la trascrizione, l'elaborazione o la stabilità a livello di RNA, o la traduzione della sequenza codificante associata. Le sequenze regolatorie possono comprendere promotori, sequenze leader di traduzione, introni, e sequenze di riconoscimento di poliadenilazione.
Un "promotore" indica una sequenza nucleotidica capace di controllare l'espressione di una sequenza codificante o di un RNA funzionale. Una sequenza codificante si trova generalmente localizzata 3' rispetto ad una sequenza promotrice. La sequenza promotrice è costituita da elementi prossimali e da elementi a monte più distali, questi ultimi essendo spesso indicati come potenziatori. Un "potenziatore" è quindi una sequenza nucleotidica in grado di stimolare l'attività del promotore, e può essere un elemento innato del promotore o un elemento eterologo inserito con l'intento di potenziare il livello o la specificità tissutale di un promotore. I promotori possono essere derivati nella loro interezza da un gene nativo, o possono essere costituiti da elementi differenti derivati da promotori differenti esistenti in natura, o possono arrivare a comprendere segmenti nucleotidici sintetici. Gli esperti del ramo sanno che promotori differenti sono in grado di dirigere l'espressione di un gene in tessuti o tipi di cellula differenti, oppure in stadi differenti dello sviluppo, come anche in risposta a condizioni ambientali differenti. I promotori che, nella maggior parte dei casi, inducono l'espressione di un frammento di acido nucleico nella maggior parte dei tipi di cellula sono comunemente indicati come "promotori costitutivi". La scoperta di nuovi promotori di vari tipi, utili in cellule di pianta, è in costante evoluzione; numerosi esempi possono essere trovati nella compilazione di Okamuro e Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Resta inoltre inteso che poiché, nella maggior parte dei casi, i confini esatti delle sequenze regolatorie non sono stati completamente definiti, frammenti di acido nucleico di lunghezze differenti possono avere un'identica attività promotrice.
La "sequenza leader di traduzione" indica una sequenza nucleotidica localizzata tra la sequenza promotrice di un gene e la sequenza codificante. La sequenza leader di traduzione è presente nell'mRNA completamente elaborato, a monte della sequenza di inizio della traduzione. La sequenza leader di traduzione può influenzare l'elaborazione del trascritto primario in un mRNA, la stabilità dell'mRNA, o l'efficacia della traduzione. Sono stati descritti esempi di sequenze leader di traduzione (Turner e Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236).
Le "sequenze non codificanti in 3'" indicano sequenze nucleotidiche localizzate a valle di una sequenza codificante, e comprendono sequenze di riconoscimento di poliadenilazione e altre sequenze codificanti per segnali regolatori capaci di influenzare l'elaborazione dell'mRNA o l'espressione del gene. Il segnale di poliadenilazione è normalmente caratterizzato dal fatto di influenzare l'addizione di tratti di acido poliadenilico all'estremità 3' del precursore di mRNA. L'uso di differenti sequenze non codificanti in 3' è esemplificato da Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680.
Il termine "trascritto di RNA" indica il prodotto ottenuto dalla trascrizione, catalizzata da una RNA polimerasi, di una sequenza di DNA. Quando il trascritto di RNA è una copia complementare perfetta della sequenza di DNA, tale trascritto prende il nome di trascritto primario, oppure può essere una sequenza di RNA derivata da un'elaborazione post-trascrizionale del trascritto primario, nel qual caso si parla di un RNA maturo. Il termine "RNA messaggero (mRNA)" indica un RNA che è privo di introni, e che può essere tradotto in un polipeptide dalla cellula. Il termine "cDNA" indica un DNA a doppio filamento che è complementare e derivato da un mRNA. Un "RNA senso" indica un trascritto di RNA comprendente l'mRNA, potendo quindi essere tradotto in un polipeptide da parte della cellula. Un "RNA antisenso" indica un trascritto di RNA che è complementare alla totalità o a parte di un trascritto primario o mRNA bersaglio, e che blocca l'espressione di un gene bersaglio (vedere il brevetto statunitense No. 5.107.065). La complementarietà di un RNA antisenso può essere nei confronti di qualsiasi parte della specifica sequenza nucleotidica, ovvero sulla sequenza non codificante in 5', sulla sequenza non codificante in 3', su introni, o sulla sequenza codificante. Un "RNA funzionale" indica un RNA senso, un RNA antisenso, un RNA di ribozima, o altro RNA che non può essere tradotto, ma che tuttavia esercita un effetto sui processi cellulari.
Il termine "legato operativamente" indica l'associazione di due o più frammenti di acido nucleico su un singolo frammento di acido nucleico, in modo tale che la funzione dell'uno sia regolata dall'altro. Ad esempio, un promotore è operativamente legato ad una sequenza codificante quando in grado di influenzare l'espressione di quella sequenza codificante (intendendo dire che la sequenza codificante si trova sotto il controllo trascrizionale del promotore). Le sequenze codificanti possono essere operativamente legate a sequenze regolatorie in un orientamento senso o antisenso.
Nel presente contesto, il termine "espressione" indica la trascrizione e l'accumulo stabile di un RNA senso (mRNA) o antisenso derivato dal frammento di acido nucleico dell'invenzione. Il termine espressione può anche indicare la traduzione di un mRNA in un polipeptide. Una "inibizione antisenso" indica la produzione di trascritti di RNA antisenso in grado di sopprimere l'espressione della proteina bersaglio. Una "sovraespressione" indica la produzione di un prodotto genico in organismi transgenici che supera i livelli di produzione riscontrabili in organismi normali o non trasformati. Una "co-soppressione" indica la produzione di trascritti di RNA senso capaci di sopprimere l'espressione di geni, estranei o endogeni, identici o sostanzialmente simili (brevetto statunitense No. 5.231.020, qui incorporato per rimando).
Il termine "livelli alterati" indica la produzione di uno o più prodotti genici in organismi transgenici, secondo quantità o rapporti differenti rispetto a quanto riscontrabile in organismi normali o non trasformati.
Una proteina "matura" indica un polipeptide elaborato in maniera post-traduzionale; ovvero un polipeptide da cui è stato rimosso qualsiasi pre- o pro-peptide presente nel prodotto primario di traduzione. Una proteina "precursore" indica il prodotto primario della traduzione di un mRNA; ovvero con i pre- e pro-peptidi ancora presenti. I pre- e pro-peptidi possono essere, senza tuttavia esserne limitati, segnali di localizzazione intracellulare.
Un "peptide di transito nei cloroplasti" è una sequenza di amminoacidi che viene tradotta in combinazione con una proteina, e che dirige la proteina verso il cloroplasto o altri tipi di plastidi presenti nella cellula in cui la proteina è generata. Una "sequenza di transito nei cloroplasti" indica una sequenza nucleotidica che codifica per un peptide di transito nei cloroplasti. Un "peptide segnale" è una sequenza di amminoacidi che viene tradotta in combinazione con una proteina, e che dirige la proteina verso il sistema secretorio (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53). Se la proteina deve essere diretta verso un vacuolo, è inoltre possibile aggiungere un segnale di localizzazione vacuolare (supra) o, se deve essere diretta verso il reticolo endoplasmatico, è possibile aggiungere un segnale di ritenzione nel reticolo endoplasmatico (supra). Se la proteina deve essere diretta verso il nucleo, qualsiasi peptide segnale presente dovrebbe essere rimosso e, al suo posto, dovrebbe essere incluso un segnale di localizzazione nucleare (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632).
Una "trasformazione" indica il trasferimento di un frammento di acido nucleico nel genoma di un organismo ospite, dando origine ad un'eredità geneticamente stabile. Gli organismi ospiti contenenti i frammenti di acido nucleico trasformati prendono il nome di organismi "transgenici". Esempi di metodi per la trasformazione di piante comprendono la trasformazione mediata da Agrobacterium (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277), e la tecnologia di trasformazione con accelerazione di particelle o "pistola genica" (Klein et al. (1987) Nature (Londra) 327:70-73; brevetto statunitense No. 4.945.050).
Nel ramo sono ampiamente note le tecniche standard di DNA ricombinante e di clonazione molecolare qui adottate, che sono descritte in maniera più esaustiva da Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (in seguito "Maniatis").
Frammenti di acido nucleico codificanti per almeno una porzione di diversi enzimi biosintetici di isopentenil difosfato sono stati isolati e identificati attraverso un confronto tra sequenze casuali di cDNA di pianta e banche dati pubbliche contenenti sequenze nucleotidiche e proteiche, avvalendosi degli algoritmi BLAST ben noti agli esperti del ramo. I frammenti di acido nucleico della presente invenzione possono essere usati per isolare cDNA e geni codificanti per proteine omologhe derivate dalle stesse o da altre specie di pianta. Nel ramo è ampiamente noto l'isolamento di geni omologhi attraverso l'uso di protocolli sequenza-dipendenti. Esempi di protocolli sequenza-dipendenti comprendono, senza tuttavia esserne limitati, metodi di ibridazione di acidi nucleici e metodi di amplificazione di DNA ed RNA, esemplificati da vari utilizzi delle tecnologie di amplificazione di acidi nucleici (ad esempio la reazione a catena della polimerasi e la reazione a catena della ligasi).
Sarebbe ad esempio possibile isolare geni codificanti per altre 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi, sotto forma sia di cDNA che di DNA genomici, usando direttamente la totalità o una parte dei presenti frammenti di acido nucleico come sonde di ibridazione di DNA per lo screening di librerie derivate da qualsiasi pianta desiderata, utilizzando una metodologia ampiamente nota agli esperti del ramo. Sonde oligonucleotidiche specifiche, basate sulle presenti sequenze di acido nucleico, possono essere progettate e sintetizzate attraverso metodi noti nel ramo (Maniatis). È inoltre possibile usare direttamente le sequenze intere per sintetizzare sonde di DNA attraverso metodi ampiamente noti al tecnico esperto, come una marcatura di DNA con primer casuali, lo spostamento di interruzioni o tecniche di marcatura d'estremità, o sonde di RNA basate su sistemi disponibili di trascrizione in vitro. È inoltre possibile progettare e utilizzare primer specifici per amplificare una parte o la totalità delle presenti sequenze. I prodotti di amplificazione risultanti possono essere marcati direttamente durante le reazioni di amplificazione, o possono essere marcati in seguito alle reazioni di amplificazione, utilizzandoli poi come sonde per isolare un cDNA a lunghezza intera, o frammenti genomici, sotto condizioni di opportuna stringenza.
È inoltre possibile utilizzare due segmenti corti dei presenti frammenti di acido nucleico in protocolli di reazione a catena della polimerasi, con lo scopo di amplificare frammenti di acido nucleico più lunghi che codificano per geni omologhi da un DNA o RNA. La reazione a catena della polimerasi può inoltre essere condotta su una libreria di frammenti clonati di acido nucleico, in cui la sequenza di un primer è derivata dai presenti frammenti di acido nucleico, mentre la sequenza dell'altro primer trae vantaggio dalla presenza dei tratti di acido poliadenilico sull'estremità 3' del precursore di mRNA codificante per geni di pianta. In alternativa, la sequenza del secondo primer può essere basata su sequenze derivate dal vettore di clonazione. Il tecnico esperto può ad esempio seguire il protocollo RACE (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8998-9002) allo scopo di generare cDNA, usando una PCR per amplificare copie della regione compresa tra un singolo punto nel trascritto e l'estremità 3' o 5'. Basandosi sulle presenti sequenze, è possibile progettare primer orientati nei sensi 3' e 5'. Usando sistemi RACE 3' o RACE 5' disponibili in commercio (BRL), è possibile isolare specifici frammenti di cDNA in 3' o 5' (Ohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673-5677; Loh et al. (1989) Science 243:217-220). I prodotti generati dalle procedure RACE 3' e 5' possono essere combinati in modo da generare cDNA a lunghezza intera (Frohman e Martin (1989) Techniques 1:165). Di conseguenza, un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotidica di almeno uno di 60 (preferibilmente uno di almeno 40, con preferenza assoluta uno di almeno 30) nucleotidi contigui, derivati da una sequenza nucleotidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, e il complemento di tali sequenze nucleotidiche, può essere usato in tali metodi per ottenere un frammento di acido nucleico codificante per una porzione sostanziale di una sequenza di amminoacidi di un polipeptide. Un frammento di acido nucleico codificante per una porzione sostanziale di un polipeptide di un gene (come le 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi), preferibilmente per una porzione sostanziale di un polipeptide di pianta di un gene, può essere ottenuto con un metodo comprendente i passaggi di: sintetizzare un primer oligonucleotidico comprendente una sequenza nucleotidica di almeno uno di 60 (preferibilmente almeno uno di 40, con preferenza assoluta almeno uno di 30) nucleotidi contigui, derivati da una sequenza nucleotidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, e il complemento di tali sequenze nucleotidiche; e amplificare un frammento di acido nucleico (preferibilmente un cDNA inserito in un vettore di clonazione) utilizzando il primer oligonucleotidico. Il frammento di acido nucleico amplificato codificherà preferibilmente per una porzione di un polipeptide.
La disponibilità delle presenti sequenze nucleotidiche e sequenze di amminoacidi dedotte facilita lo screening immunologico di librerie di espressione di cDNA. È possibile sintetizzare peptidi sintetici che rappresentino porzioni delle presenti sequenze di amminoacidi. Questi peptidi possono essere utilizzati per immunizzare animali, in modo da produrre anticorpi policlonali o monoclonali provvisti di specificità per peptidi o proteine comprendenti le sequenze di amminoacidi. Questi anticorpi possono essere quindi usati per lo screening di librerie di espressione di cDNA, allo scopo di isolare cloni di cDNA a lunghezza intera d'interesse (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1-34; Maniatis).
I frammenti di acido nucleico della presente invenzione possono essere usati per creare piante transgeniche, in cui i polipeptidi divulgati sono presenti a livelli superiori o inferiori alla norma, oppure in tipi di cellula o in stadi dello sviluppo in cui non sono normalmente presenti. Ciò avrebbe l'effetto di alterare il livello di IPP plastidico in quelle cellule. Dato che la via mevalonato- indipendente appare essere esclusiva di microorganismi e plastidi di pianta, gli inibitori di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi non dovrebbero avere effetto sugli animali, rendendo questo enzima un eccellente candidato erbicida. Una sovraespressione del gene di 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi produrrà l'enzima attivo per uno screening ad alto rendimento atto ad individuare inibitori per questo enzima. Questi inibitori possono portare alla scoperta di nuovi erbicidi.
La sovraespressione delle proteine della presente invenzione può essere ottenuta costruendo in primo luogo un gene chimerico in cui la regione codificante è legata, in modo operativo, ad un promotore in grado di dirigere l'espressione di un gene nei tessuti desiderati e nello stadio desiderato di sviluppo. Per ragioni di convenienza, il gene chimerico può comprendere sequenze promotrici e sequenze leader di traduzione derivate dagli stessi geni. È inoltre possibile fornire sequenze non codificanti in 3' che codificano per segnali di terminazione della trascrizione. Per facilitare l'espressione genica, il presente gene chimerico può anche comprendere uno o più introni.
È quindi possibile costruire vettori plasmidici comprendenti il presente gene chimerico. La selezione del vettore plasmidico è subordinata al metodo che sarà usato per trasformare le piante ospiti. Il tecnico esperto è ben consapevole degli elementi genetici che devono essere presenti sul vettore plasmidico per riuscire a trasformare, selezionare e propagare le cellule ospiti contenenti il gene chimerico. Il tecnico esperto riconoscerà inoltre che eventi di trasformazione indipendenti e differenti comporteranno livelli e modelli differenti di espressione (Jones et al. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), e quindi che, per ottenere linee con il livello e il modello desiderati di espressione, è necessario sottoporre a screening una pluralità di eventi. Tale screening può essere condotto mediante analisi Southern di un DNA, analisi Northern dell'espressione di un mRNA, analisi Western dell'espressione di una proteina, o analisi dei fenotipi.
Per alcune applicazioni, può essere utile dirigere il presente polipeptide verso differenti compartimenti cellulari, o facilitare la sua secrezione della cellula. È stato quindi pensato che il gene chimerico sopra descritto possa essere ulteriormente integrato alterando la sequenza codificante affinché codifichi per il presente polipeptide, con l'aggiunta di opportune sequenze di localizzazione intracellulari, come sequenze di transito (Keegstra (1989) Cell 56:247-253), sequenze segnale, o sequenze codificanti per una localizzazione nel reticolo endoplasmatico (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53), o segnali di localizzazione nucleare (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632), e / o con la rimozione di sequenze di localizzazione già presenti. Benché i rimandi citati forniscano esempi per ciascuno di questi segnali, l'elenco non è esaustivo, e in futuro potrebbero essere scoperti ulteriori segnali di localizzazione utili.
In alcune applicazioni, può anche risultare desiderabile ridurre o eliminare l'espressione di geni codificanti per i presenti polipeptidi in piante. Per conseguire tale scopo, è possibile costruire un gene chimerico progettato per la co-soppressione del presente polipeptide, legando un gene o frammento genico codificante per questo polipeptide a sequenze promotrici di pianta. In alternativa, è possibile costruire un gene chimerico progettato per esprimere un RNA antisenso per la totalità o parte del presente frammento di acido nucleico, legando il gene o frammento genico alle sequenze promotrici di pianta secondo un orientamento inverso. Sia i geni chimerici di co-soppressione che quelli antisenso possono essere introdotti in piante attraverso una trasformazione in cui l'espressione dei corrispondenti geni endogeni viene ridotta o eliminata.
Le soluzioni di genetica molecolare per la generazione di piante con un'espressione genica alterata hanno un chiaro vantaggio rispetto ad approcci più tradizionali di incrocio agronomico. Per produrre alterazioni in fenotipi di pianta, è possibile inibire in modo specifico l'espressione di uno o più geni tramite un'inibizione antisenso o una co-soppressione (brevetti statunitensi No. 5.190.931. 5.107.065 e 5.283.323). Un costrutto antisenso o di co-soppressione agirebbe da regolatore negativo dominante per l'attività genica. Benché mutazioni convenzionali possano causare una regolazione negativa dell'attività genica, questi effetti sono con tutta probabilità recessivi. La regolazione negativa dominante disponibile con un approccio transgenico può risultare vantaggiosa nell'ottica di un incrocio. Inoltre, la capacità di limitare l'espressione di un fenotipo specifico nei tessuti riproduttivi della pianta, attraverso l'uso di promotori tessuto-specifici, può conferire vantaggi agronomici rispetto a mutazioni convenzionali, che possono esercitare un effetto in tutti i tessuti in cui viene ordinariamente espresso un gene mutante.
La persona esperta del ramo sarà consapevole dell'esistenza di considerazioni speciali associate all'uso delle tecnologie antisenso o di co-soppressione, allo scopo di ridurre l'espressione di geni particolari. Il livello opportuno di espressione di geni senso o antisenso può ad esempio richiedere l'impiego di geni chimerici differenti che adoperano elementi regolatori differenti noti al tecnico esperto. Una volta ottenute piante transgeniche con uno dei metodi sopra descritti, sarà necessario sottoporre a screening i singoli organismi transgenici, alla ricerca di quelli esibenti il fenotipo desiderato con l'efficacia maggiore. Il tecnico esperto svilupperà dunque metodi per sottoporre a screening grandi numeri di trasformanti. La natura di questi screening sarà generalmente selezionata in base a considerazioni pratiche, e non costituisce una parte intrinseca dell'invenzione. È ad esempio possibile eseguire uno screening alla ricerca di variazioni dell'espressione genica, utilizzando anticorpi specifici per la proteina codificata dal gene da sopprimere, oppure sarebbe possibile stabilire saggi che misurano specificatamente l'attività enzimatica. Un metodo preferito sarà uno che permette di elaborare rapidamente grandi numeri di campioni, essendo previsto che un grande numero di trasformanti risulterà negativo per il fenotipo desiderato.
I presenti polipeptidi (o loro porzioni) possono essere prodotti in cellule ospiti eterologhe, in particolare nelle cellule di ospiti microbici, e possono essere utilizzati per preparare anticorpi contro queste proteine, attraverso metodi ampiamente noti agli esperti del ramo. Gli anticorpi sono utili per rilevare i polipeptidi della presente invenzione in situ, all'interno di cellule, o in vitro, all'interno di estratti cellulari. Cellule ospiti eterologhe preferite per la produzione dei presenti polipeptidi sono ospiti microbici. Gli esperti del ramo sono ampiamente a conoscenza di noti sistemi di espressione microbica, e di vettori di espressione contenenti sequenze regolatorie che inducono alti livelli di espressione di proteine estranee. Per costruire un gene chimerico da utilizzare nella produzione dei presenti polipeptidi, sarebbe possibile usare qualsiasi di questi sistemi. Questo gene chimerico potrebbe quindi essere introdotto in adatti microrganismi mediante trasformazione, fornendo un'espressione di alto livello della 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi codificata. È fornito un esempio di vettore per ottenere alti livelli di espressione dei presenti polipeptidi in un ospite batterico (esempio 6).
Inoltre, i presenti polipeptidi possono essere usati come bersagli per facilitare la progettazione e / o l'identificazione di inibitori di quegli enzimi che possono essere utili come erbicidi. Ciò è desiderabile in quanto il polipeptide qui descritto catalizza la sintesi dell'isopentenil difosfato attraverso la via indipendente dal mevalonato. Pertanto, l'inibizione dell'attività dell'enzima qui descritto potrebbe portare a inibire la crescita di una pianta. L'inibizione dell'attività di una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi potrebbe dunque portare a inibire la crescita di una pianta. I presenti polipeptidi potrebbero quindi essere adatti per la scoperta e la progettazione di nuovi erbicidi.
È inoltre possibile utilizzare la totalità o una parte sostanziale dei frammenti di acido nucleico della presente invenzione come sonde per mappare, geneticamente o fisicamente, i geni a cui appartengono, e come marcatori per tratti collegati a quei geni. Tali informazioni possono essere utili in un incrocio di piante mirato a sviluppare linee provviste di fenotipi desiderati. I presenti frammenti di acido nucleico possono ad esempio essere usati come marcatori per il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Con i frammenti di acido nucleico della presente invenzione, è possibile sondare Southern blot (Maniatis) di DNA genomico di pianta digerito mediante restrizione. Per costruire una mappa genetica, è quindi possibile sottoporre ad analisi genetiche i modelli di bandeggio risultanti, usando programmi per computer come MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181). I frammenti di acido nucleico della presente invenzione possono anche essere usati per sondare Southern blot contenenti DNA genomici, trattati con endonucleasi di restrizione, di un gruppo di individui che rappresentano il genitore e la prole di un incrocio genetico definito. La segregazione dei polimorfismi di DNA è nota, e viene impiegata per calcolare la posizione della presente sequenza di acido nucleico nella mappa genetica precedentemente ottenuta utilizzando questa popolazione (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
La produzione e l'impiego di sonde derivate da geni di pianta da usare nella mappatura genetica sono descritti in Bernatzky e Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41. Numerose pubblicazioni descrivono la mappatura genetica di specifici cloni di cDNA, avvalendosi della metodologia sopra delineata o di sue varianti. Per la mappatura è possibile usare popolazioni di incrocio F2, popolazioni di incrocio ripetuto, popolazioni accoppiate in modo casuale, linee quasi isogeniche, e altri gruppi di individui. Tali metodologie sono ampiamente note agli esperti del ramo.
Sonde di acido nucleico derivate dalle presenti sequenze di acido nucleico possono essere usate per una mappatura fisica (ovvero per il posizionamento di sequenze su mappe fisiche; vedere Hoheisel et al. In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, pagg. 319-346, e rimandi citati al suo interno).
In un'altra forma esecutiva, sonde di acido nucleico derivate dalle presenti sequenze di acido nucleico possono essere utilizzate in una mappatura diretta per ibridazione in situ con fluorescenza (FISH, fluorescence in situ hybridization) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Benché i metodi correnti di mappatura FISH favoriscano l'uso di grandi cloni (da numerose KB a diverse centinaia di KB; vedere Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), migliorando la sensibilità è possibile rendere disponibili le prestazioni della mappatura FISH all'uso di sonde più corte.
Utilizzando le presenti sequenze di acido nucleico, è possibile condurre una varietà di metodi di mappatura genetica e fisica basati sull'amplificazione di acidi nucleici. Esempi comprendono l'amplificazione allele-specifica (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), il polimorfismo di frammenti amplificati via PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), il legame allele-specifico (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), le reazioni di estensione nucleotidica (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), la mappatura di ibridi di radiazione (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) e la mappatura Happy (Dear e Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Per questi metodi, la sequenza di un frammento di acido nucleico viene usata per progettare e produrre coppie di primer da adoperare nella reazione di amplificazione o nelle reazioni di estensione dei primer. La progettazione di tali primer è ben nota agli esperti del ramo. In metodi che impiegano una mappatura genetica basata su PCR, può essere necessario identificare le differenze di sequenza di DNA tra i genitori dell'incrocio di mappatura nella regione corrispondente alla presente sequenza di acido nucleico. Ciò non è comunque generalmente necessario per i metodi di mappatura.
Fenotipi mutanti per la perdita di funzione possono essere identificati per i presenti cloni di cDNA o attraverso protocolli di distruzione genica localizzata, o identificando specifici mutanti per questi geni contenuti in una popolazione di granturco portatrice di mutazioni in tutti i geni possibili (Ballinger e Benzer (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9402-940.6; Koes et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:8149-8153; Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84). Quest'ultimo approccio può essere implementato in due modi. Nel primo caso, è possibile utilizzare corti segmenti dei presenti frammenti di acido nucleico in protocolli di reazione a catena della polimerasi, in combinazione con un primer di sequenza marcatrice di mutazione, su DNA preparati da una popolazione di piante in cui sono stati introdotti trasposoni Mutator o un certo altro elemento di DNA causativo di mutazione (vedere Bensen, supra). L'amplificazione di uno specifico segmento di DNA con questi primer indica l'inserimento dell'elemento marcatore di mutazione dentro o in prossimità del gene di pianta codificante per i presenti polipeptidi. In alternativa, il presente frammento di acido nucleico può essere utilizzato come sonda di ibridazione contro prodotti di amplificazione PCR generati dalla popolazione di mutazioni, usando il primer di sequenza marcatrice di mutazione in combinazione con un primer di sito genomico arbitrario, come quello per un adattatore sintetico ancorato a siti di enzimi di restrizione. Con uno qualunque dei due metodi, è possibile identificare e ottenere una pianta contenente una mutazione nel gene endogeno codificante per i presenti polipeptidi. Questa pianta mutante può essere poi usata per determinare o confermare la funzione naturale dei presenti polipeptidi qui divulgati.
ESEMPI
La presente invenzione è ulteriormente definita nei seguenti esempi, in cui tutte le parti e percentuali sono in peso e i gradi sono in Celsius, se non diversamente specificato. Resta inteso che tali esempi, benché indicanti forme esecutive preferite dell'invenzione, sono forniti a mero titolo illustrativo.
ESEMPIO 1
Composizione delle librerie di cDNA; Isolamento e sequenziamento di cloni di cDNA
Sono state preparate librerie di cDNA in rappresentanza degli mRNA di vari tessuti di granturco, riso, soia e frumento. Le caratteristiche delle librerie sono descritte sotto.
TABELLA 2
Librerie di cDNA di granturco, riso, soia e frumento
Libreria Tessuto Clone
cen3n Endosperma di granturco 20 giorni dopo l'impollinazione* cen3n.pk0157.e12
cholc Embrione di granturco 20 giorni dopo l'impollinazione cho1c.pk004.f12
cr1n Radice di granturco da piantine di 7 giorni* cr1n.pk0095.g3
csi1 Barba di granturco csi1.pk0041.f11
p0004 Pannocchia immatura di granturco p0004.cb1hh74r
p0006 Getto giovane di granturco p0006.cbyvo28r
p0012 3 / 4 intermedi della terza lamina fogliare e della nervatura mediana di foglie verdi di granturco trattate con acido jasmonico (1 mg / ml in Tween 20 0,02 %) 24 ore prima della raccolta p0012.cg1ac07r
rlr6 Foglia di riso 15 giorni dopo la germinazione, 6 ore dopo l'infezione del ceppo Magaporthe grisea 4360-R-62 (AVR2-YAMO); resistente rlr6.pk0073.d5
ses2w Sospensione embriogenica di soia due settimana dopo la subcoltura ses2w.pk0029.e5
sgc3c Cotiledone di soia 14-21 giorni dopo la germinazione (quando inizia ad ingiallirsi) sgc3c.pk001.d16
sl1 Piantine di soia in sviluppo di due settimane sl1.pk0021.a6
sl1 Piantine di soia in sviluppo di due settimane sl1.pk0036.a5
sl1 Piantine di soia in sviluppo di due settimane sl1.pk152.i19
sl2 Piantine di soia in sviluppo di due settimane trattate con 2,5 ppm di clorimuron sl2.pk0039.d4
sl2 Piantine di soia in sviluppo di due settimane trattate con 2,5 ppm di clorimuron sl2.pk0111.c9
sl2 Piantine di soia in sviluppo di due settimane trattate con 2,5 ppm di clorimuron sl2.pk124.p17
sml1c Foglia matura di soia sml1c.pk001.c15
sml1c Foglia matura di soia sml1c.pk005.a24
srl Radice di soia sr1.pk0008.d1
srm Meristema di radice di soia srm.pk0014.f8
wlm12 Piantine di frumento 12 ore dopo l'inoculazione con Erysiphe graminis f. sp tritici wlm12.pk0003.d11
wlm24 Piantine di frumento 24 ore dopo l'inoculazione con Erysiphe graminis f. sp tritici wlm24.pk0014.d7
wr1 Radice di frumento da una piantina di 7 giorni wr1.pk0084.a4
*Queste librerie sono state normalizzate essenzialmente come descritto nel brevetto statunitense No. 5.482.845.
Le librerie di cDNA possono essere preparate con qualsiasi di numerosi metodi disponibili. Ad esempio, i cDNA possono essere introdotti in vettori plasmidici preparando innanzitutto le librerie di cDNA in vettori Uni-ZAPTM XR, secondo il protocollo del produttore (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Le librerie Uni-ZAPTM XR vengono convertite in librerie plasmidiche secondo il protocollo fornito da Stratagene. Dopo la conversione, gli inserti di cDNA risulteranno contenuti all'interno del vettore plasmidico pBluescript. Inoltre, i cDNA possono essere introdotti direttamente in vettori Bluescript II SK( ) (Stratagene) pretagliati, utilizzando la T4 DNA ligasi (New England Biolabs), con conseguente trasfezione in cellule DH10B secondo il protocollo del produttore (GIBCO BRL Products). Una volta che gli inserti di cDNA si trovano all'interno dei vettori plasmidici, i DNA plasmidici vengono preparati da colonie batteriche, prelevate in modo casuale, contenenti plasmidi pBluescript ricombinanti, o le sequenze di cDNA di inserto vengono amplificate tramite reazione a catena della polimerasi, adoperando primer specifici per sequenze vettore che fiancheggiano le sequenze di cDNA inserite. I DNA di inserto amplificati o i DNA plasmidici amplificati vengono sequenziati in reazioni di sequenziamento con primer- colorante, generando sequenze parziali di cDNA (etichette di sequenza espresse o "EST"; vedere Adams et al., (1991) Science 252:1651-1656). Le EST risultanti vengono analizzate usando un sequenziatore fluorescente Perkin Elmer, modello 377.
ESEMPIO 2
Identificazione di cloni di cDNA
Le EST codificanti per enzimi biosintetici di isopentenil difosfato sono state identificate conducendo ricerche BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; vedere anche www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST / ) per la somiglianza a sequenze contenute nella banca dati BLAST "nr" (comprendente tutte le traduzioni CDS di GenBank non ridondanti, sequenze derivate dalla banca dati Brookhaven Protein Data Bank a struttura tridimensionale, l'ultima release principale delle banche dati di sequenze proteiche SWISS-PROT, e le banche dati EMBL e DDBJ). Le sequenze di cDNA ottenute nell'esempio 1 sono state analizzate, in termini di somiglianza, con tutte le sequenze di DNA disponibili al pubblico contenute nella banca dati "nr", usando l'algoritmo BLASTN fornito dal National Center for Biotechnology Information (NCBI). Le sequenze di DNA sono state tradotte in tutte le cornici di lettura e sono state raffrontate, in termini di somiglianza, con tutte le sequenze proteiche disponibili al pubblico contenute nella banca dati "nr", usando l'algoritmo BLASTX (Gish e States (1993) Nat. Genet. 3:266-272) fornito da NCBI. Per convenienza, il valore P (probabilità) di osservare una corrispondenza meramente fortuita tra una sequenza di cDNA e una sequenza contenuta nelle banche dati esaminate, come calcolato da BLAST, è qui riportato sotto forma di valori "pLog", che rappresentano il negativo del logaritmo del valore P riportato. Quindi, maggiore è il valore di pLog, maggiore è la probabilità che la sequenza di cDNA e la "risposta" di BLAST rappresentino proteine omologhe.
ESEMPIO 3
Caratterizzazione di cloni di cDNA codificanti per una 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi
La ricerca BLASTX usando le sequenze EST dei cloni elencati nella Tabella 3 ha rivelato una somiglianza dei polipeptidi codificati dai cDNA con la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi di Synechocystis PCC6803 ed Escherichia coli (identificatori generali NCBI No. 1001556 e 3434984). Nella Tabella 3 sono mostrati i risultati BLAST per le singole EST ("EST"), per contig assemblati da due o più EST ("Contig"), o per sequenze codificanti per la proteina intera, derivate dagli inserti interi di cDNA comprendenti i cloni di cDNA indicati ("FIS"), un contig, o un FIS e una PCR ("CGS"):
TABELLA 3
Risultati BLAST per sequenze codificanti per polipeptidi omologhi alla 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi
Punteggio pLog BLAST
Clone Stato 1001556 3434984
Contig di: Contig 14,40 10,70
p0004.cb1hh74r
p0012.cglac07r
p0006.cbyvo28r
Contig di: Contig 111,0 59,52
cen3n.pk0157.e12
cr1n.pk0095.g3
cho1c.pk004.f12
csi1.pk0041.f11
rlr6.pk0073.d5 CGS 164,0 94,0
Contig di: CGS 154,0 85,50
sml1c.pk001.c15
sml1c.pk005.a24
sl1.pk0021.a6
sl2.pk124.p17
sl1.pk0036.a5
sl2.pk0111.c9
sl1.pk152.i19
sl2.pk0039.d4
Contig di: Contig 64,40 32,40
sr1.pk0008.d1
sr1.pk0007.c11
srm.pk0014.f8
Contig di: Contig 12,70 9,30
wlm12.pk0003.d11
wr1.pk0084.a4
wlm24.pk0014.d7 EST 24,70 10,70
Un ulteriore sequenziamento di alcuni dei suddetti cloni ha fornito nuove informazioni. La ricerca BLASTX usando le sequenze nucleotidiche dei cloni elencati nella Tabella 4 ha rivelato una somiglianza dei polipeptidi codificati dai cDNA con la 1-desossi-D-xilulosio 5-fosfato reduttoisomerasi di Arabidopsis thaliana, Mentha x piperita e Synechocystis sp. (identificatori generali NCBI No. 4886307, 4581856 e 2496789, ris
Da Inglese a Italiano: A Cutting Insert With A Varying Chamfer Angle At The Nose Cutting Edge (by Seco Tools AB SE) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese A CUTTING INSERT WITH A VARYING CHAMFER ANGLE AT THE NOSE CUTTING EDGE
Description
Background of the invention
The present invention relates to a metal cutting insert that is primarily intended for turning operations.
For all sorts of turning operations, there is a certain interplay between the feed rate and the corner radius, the corner radius being the connection between the main cutting edge and the secondary cutting edge. The surface fineness produced on the workpiece is specifically influenced by the interplay between the corner radius and the feed rate. The approach angle is defined as the angle between the main cutting edge and the direction of feed. This angle has a considerable influence on the interrelation between the different cutting force components, and thereby also on the surface fineness and dimension accuracy. Surface fineness and dimension accuracy are very sensitive to changes of the approach angle. One problem for all turning operations is to obtain the desired surface fineness. Another problem is poor tool life.
Embodiments of prior cutting inserts are shown in EP 1226892 A2, which discloses a cutting insert according to the preamble of claim 1, and DE 10308234 A1.
Objects of the invention
One object of the present invention is to provide a cutting insert that improves the fineness of the machined surface.
Another object of the present invention is to provide a cutting insert that significantly improves tool life.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that improves surface finish over the total tool life.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that reduces influence on residual stresses in the work piece surface.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that reduces influence on hardness in the workpiece surface.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that reduces the sensitivity of a turning cutting insert relative to the positioned approach angle.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that reduces the radial forces during turning.
Still another object of the present invention is to provide a cutting insert that reduces provides for a smaller variation in cutting edge position when used in a tool holder.
These and further objects have been attained by a cutting insert as defined in the charactering portion of appended independent claim.
Brief description of the drawings
The objects and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description of preferred embodiments thereof in connection with the accompanying drawing in which like numerals designate like elements, and in which:
FIG. 1 shows a plan view of a turning cutting insert according to the invention.
FIG. 2 shows the cutting insert in a perspective view.
FIG. 3A shows a cross-section according to the line E in Fig. 1.
FIG. 3B shows a cross-section according to the line F in Fig. 1.
FIG. 3C shows a cross-section according to the line G in Fig. 1.
FIG. 3D shows a cross-section according to the line H in Fig. 1.
FIG. 3E shows a cross-section according to the line J in Fig. 1.
FIG. 4 shows a plan view of a corner portion of the cutting insert in magnification and in plan view.
FIG. 5 shows the corner portion in a side view.
FIG. 6A shows a graph of chamfer angle range at the different cross-sections according to lines E-J in Fig. 1.
FIG. 6B shows a graph of chamfer height at the different cross-sections according to lines E-J in Fig. 1.
FIG. 7A shows the cutting insert during turning of a work piece and Fig. 7B shows portions of the cutting insert and the workpiece.
Detailed description of preferred embodiments of the invention
In the figures 1 to 5 a turning cutting insert 10 according to the present invention is shown. The cutting insert may be either single- or double-sided. The cutting insert is rhombic, the corner portion shown in FIG. 1 having a nose angle of about 60 to 80°. However, it may also be square, rectangular, triangular or hexagonal. When it is hexagonal, it may also be in the form of a so-called trigonal insert. The insert in this embodiment is made of cemented carbide having a cubic boron nitride (CBN) corner portion, but may also be made completely of any of those materials or of any other suitable material. The cutting insert 10 comprises an upper surface 11, a lower surface 12 substantially parallel with said upper surface, and at least three side surface 13A,13B extending between said upper and lower surfaces. The upper surface 11 is planar in this embodiment and extends perpendicularly relative to said at least three side surfaces. A transition between two adjacent side surfaces 13A,13B forms a rounded nose radius surface 14A at a cutting insert corner 14.
The cutting insert 10 comprises a peripheral land 15, constituted by at - least two peripheral lands 15A and 15B, bridging the upper and side surfaces at least at the corner portion 14. The peripheral lands 15A and 15B in this embodiment encircles the entire cutting insert periphery. The peripheral lands 15A and 15B in this embodiment are of different configuration. The peripheral lands 15A and 15B slope at chamfer angles βA-βE (as illustrated by Figs. 3A-3E) relative to a plane P containing the upper surface 11. The peripheral land is adapted to strengthen the cutting edges of the cutting insert. In this embodiment the upper surface 11 is planar and connects directly to the peripheral land 15 to allow a strong configuration. An intersection of the peripheral land 15 and the nose radius surface 14A forms a nose cutting edge 16. The nose cutting edge 16 is defined by at least one radius R1. Each operative cutting corner 14 comprises at least one convex wiper edge 17, 18 connected to the nose cutting edge 16. In this embodiment there is provided a first 17 and a second 18 wiper edge separated by the nose cutting edge 16. The nose radius surface 14A may be symmetrical with respect to the corner bisector B. This results in the advantage that the cutting insert becomes symmetrical, thereby enabling both left-hand and right-hand turning with the same insert, i.e., both left-hand and right-hand holders may be used for this cutting insert. The cutting insert 10 in this embodiment has a through-going hole 21 extending perpendicularly to the surfaces 11 and 12.
Referring especially to Figs. 3C and for example 3E, the chamfer angle βc in a cross-section at the nose cutting edge 16 is larger than the chamfer angle βE in a cross-section a distance away from the nose cutting edge 16. The chamfer angle βC in the cross-section at the nose cutting edge 16 is larger than the chamfer angle in a cross-section at said first 17 or second 18 wiper edge. The peripheral land 15A and 15B follows a substantially straight line in a cross-section through the cutting insert 10, such as shown in Figs. 3A-3E. The peripheral land 15 has a continuously varying chamfer angle β at the corner portion 14. The chamfer angle βC, in a cross-section as illustrated by Fig. 3C at the nose cutting edge 16, is larger than the chamfer angle βE in a cross-section at the first wiper edge 17. The peripheral land 15 in a plan view has a substantially constant width WA WE, as illustrated by Figs. 3A-3E. The land width WE is however slightly larger than the widths WA-WD. Alternatively, the land widths may vary similar to the variations of the chamfer angle.
The first wiper edge 17 is defined by at least one first wiper radius R2 and the second wiper edge 18 is defined by at least one second wiper radius R3, said radii R1-R3 have different points of origin. The radii R2 and R3 can be equally large. The peripheral land 15 at each first and second wiper edge 17, 18 has a continuously varying chamfer angle β. Referring to Figs. 3A-3E and Fig. 6A and 6B, the angle βA is chosen within the range 5 to 20°; the angle βB is chosen within the range 10 to 30°; the angle βC is chosen within the range 15 to 60°; the angle βD is chosen within the range 10 to 30°, and the angle βE is chosen within the range 5 to 20°. Furthermore, the projected height Z of the chamfer when viewed perpendicular to the side surface 13A, 13B or nose radius surface 14A may vary in the range disclosed in Fig. 6B or as follows (in mm):
A B C D E
0.004 0.009 0.01 0.009 0.004
0.18 0.29 0.86 0.29 0.18
Referring now to Figs. 7A and 7B that show the cutting insert during turning of a work piece 19 and an enlarged portion of the cutting insert and the workpiece during a hard turning process, respectively. Usually the depth of cut Y is equal to or less than the nose cutting edge radius R1, such that the uncut material for example does not reach the bisector B. The insert is positioned with a clearance angle σ beyond the wiper edge 17. The size of the chip 20 to be removed is determined by the depth of cut Y and the feed per revolution X. The thickness of the chip transfers into zero at the convex wiper edge 17. Since the peripheral land 15 has a chamfer that is most blunt at the bisector of the corner portion 14 that portion withstands wear while the wiper edge 17 that cuts the thin part of the chip is relatively sharp a good surface fineness is obtained. The fact that that the peripheral land 15, 15A,1 5B in a plan view has a substantially constant width WA-WE provides for a smaller variation in cutting edge position when used in a tool holder.
In the described embodiment the active corner of the cutting insert is a section of CBN and thus the cutting edges 16, 17 and 18 are comprised of CBN. Alternatively any other suitable cutting material can be used all due the machining application.
When using cutting inserts having wiper edges the radial forces become high compared to conventional cutting inserts without wiper edges. A cutting insert according to the present invention has a more blunt chamfer angle about the bisector of its cutting corner to protect the corner from breakage during high feeds while the wiper edge has a less blunt to diminish the radial forces. Thus, a cutting insert for turning is proposed that improves the fineness of the machined surface and significantly improves tool life.
Claims
1. A cutting insert for turning comprising an upper surface (11), a lower surface (12) substantially parallel with said upper surface, and at least three side surfaces (13A,13B) extending between said upper and lower surfaces, a transition between two adjacent side surfaces (13A,13B) forming a rounded nose radius surface (14A) at a cutting insert corner (14), said cutting insert comprising a peripheral land (15,15A,15B) bridging the upper and side surfaces at least at the corner portion (14) at a chamfer angle (βA-βE), and an intersection of said land (15,15A,15B) and said nose radius surface (14A) forming a nose cutting edge (16), said nose cutting edge (16) being defined by at least one radius (R1), said cutting corner comprising at least one curved wiper edge (17,18), Whereby
the chamfer angle (βc) in a cross-section at the nose cutting edge (16) is larger than the chamfer angle in a cross-section a distance away from the nose cutting edge (16) and characterized in that the peripheral land (15,15A,15B) in a plan view has a substantially constant width (WA-WE).
2. The cutting insert according to claim 1, characterized in that the chamfer angle (βc) in the cross-section at the nose cutting edge (16) is larger than the chamfer angle in a cross-section at said wiper edge.
3. The cutting insert according to claim 1 or 2, characterized in that the peripheral land is provided as a chamfer (15) encircling the entire cutting insert periphery.
4. The cutting insert according to anyone of the preceding claims, chara cterized in that the peripheral land (15,15A,15B) follows a substantially straight line in a cross-section through the cutting insert.
5. The cutting insert according to anyone of the preceding claims, chara cterized in that the peripheral land (15,15A,15B) has a continuously varying chamfer angle (β) at the corner portion (14).
6. The cutting insert according to claim 5, characterized in that the chamfer angle (βC) in a cross-section at the nose cutting edge (16) is larger than the chamfer angle (βE) in a cross-section at a first wiper edge (17,18).
7. The cutting insert according to anyone of the preceding claims, chara cterized in that the cutting corner (14) comprises a first wiper edge being defined by at least one radius (R2) and a second wiper edge being defined by at least one radius (R3), said radii (R1-R3) have different points of origin.
8. The cutting insert according to claim 7, characterized in that each first and second wiper edge (17,18) has a continuously varying chamfer angle (β).
9. The cutting insert according to anyone of the preceding claims, characterized in that the cutting insert (10) partly or completely is comprised of cubic boron nitride.
Traduzione - Italiano Titolo: INSERTO DA TAGLIO CON ANGOLO DI SMUSSO VARIABILE IN CORRISPONDENZA DEL TAGLIENTE IN PUNTA
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DESCRIZIONE
Sfondo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce ad un inserto metallico da taglio che è principalmente pensato per operazioni di tornitura.
Per tutti i tipi di operazioni di tornitura, vi è una certa interazione tra la velocità di avanzamento ed il raggio d’angolo, il raggio d’angolo essendo il collegamento tra il tagliente principale ed il tagliente secondario. La finezza superficiale prodotta sul pezzo da lavoro è nello specifico influenzata dall’interazione tra il raggio d’angolo e la velocità di avanzamento. L’angolo di attacco è definito come l’angolo tra il tagliente principale e la direzione di avanzamento. Questo angolo ha una influenza notevole sull’interdipendenza tra le differenti componenti della forza di taglio, e così pure sulla finezza superficiale e sull’accuratezza dimensionale. La finezza superficiale e l’accuratezza dimensionale sono molto sensibili ai cambiamenti nell’angolo di attacco. Un problema per tutte le operazioni di tornitura è quello di ottenere la desiderata finezza superficiale. Un altro problema è la scarsa vita dell’utensile.
Le forme di realizzazione degli inserti da taglio della tecnica anteriore sono mostrate nel documento EP 1226892 A2, il quale descrive un inserto da taglio in accordo con il preambolo della rivendicazione 1, e nel documento DE 10308234 A1.
Scopi dell’invenzione
Uno scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che migliori la finezza della superficie lavorata a macchina.
Un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che aumenti in modo significativo la vita dell’utensile.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che aumenti la finezza superficiale per tutta la vita dell’utensile.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che riduca l’influenza delle tensioni residue nella superficie del pezzo da lavoro.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che riduca l’influenza sulla durezza nella superficie del pezzo da lavoro.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che riduca la sensibilità di un inserto da taglio per tornitura rispetto all'angolo di attaccio disposto.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che riduca le forze radiali durante la tornitura.
Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un inserto da taglio che preveda una inferiore variazione della posizione del tagliente quando viene usato in un portautensile.
Questi ed altri scopi vengono ottenuti tramite un inserto da taglio come definito nella porzione caratterizzante della rivendicazione indipendente in allegato.
Breve Descrizione dei Disegni
Gli scopi ed i vantaggi dell’invenzione diverranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata delle sue forme di realizzazione preferite insieme ai disegni in allegato, in cui numeri simili indicano elementi simili, ed in cui:
la fig. 1 mostra una vista in pianta di un inserto da taglio per tornitura in accordo con l’invenzione.
La fig. 2 mostra l’inserto da taglio in una vista in prospettiva.
La fig. 3A mostra una sezione trasversale secondo la linea E in fig. 1.
La fig. 3B mostra una sezione trasversale secondo la linea F in fig. 1.
La fig. 3C mostra una sezione trasversale secondo la linea G in fig. 1.
La fig. 3D mostra una sezione trasversale secondo la linea H in fig. 1.
La fig. 3E mostra una sezione trasversale secondo la linea J in fig. 1.
La fig. 4 mostra una vista in pianta di una porzione d’angolo dell’inserto da taglio ingrandita e con vista in pianta.
La fig. 5 mostra la porzione d’angolo in una vista laterale.
La fig. 6A mostra un grafico dell'intervallo dell’angolo di smusso con differenti sezioni trasversali secondo le linee E – J di fig. 1.
La fig. 6B mostra un grafico dell’altezza dello smusso con differenti sezioni trasversali secondo le linee E – J di fig. 1.
La fig. 7A mostra l’inserto da taglio durante la tornitura di un pezzo da lavoro e la fig. 7B mostra porzioni dell’inserto da taglio e del pezzo da lavoro.
Descrizione dettagliata delle forme di realizzazione preferite dell’invenzione
Nelle figure da 1 a 5 viene mostrato un inserto da taglio per tornitura 10 secondo la presente invenzione. L’inserto dal taglio potrebbe utilizzato su di un lato solo o su due lati. L’inserto da taglio è di forma rombica, la porzione d’angolo mostrata in fig. 1 possedendo un angolo in punta di circa 60° fino a 80°. Tuttavia, esso potrebbe anche essere quadrato, rettangolare, triangolare od esagonale. Quando è esagonale, esso potrebbe anche avere la forma di un cosiddetto inserto trigonale. L'inserto in questa forma di realizzazione è realizzato in carburo cementato avente una porzione d’angolo in nitruro di boro cubico (CBN), ma potrebbe anche essere completamente realizzato in uno qualsiasi di questi materiali od in un qualsiasi materiale adatto. L’inserto da taglio 10 comprende una superficie superiore 11, una superficie inferiore 12 sostanzialmente parallela a detta superficie superiore, ed almeno tre superfici laterali 13A, 13B che si sviluppano tra dette superfici superiore ed inferiore. La superficie superiore 11 è piana, in questa forma di realizzazione, e si estende in perpendicolare rispetto a dette almeno tre superfici laterali. Una zona di transizione tra due superfici laterali adiacenti 13A, 13B forma una superficie di raggio in punta arrotondata 14A in corrispondenza dell’angolo dell’inserto da taglio 13.
L’inserto da taglio 10 comprende una faccetta periferica 15, costituita da almeno due faccette periferiche 15A e 15B, che uniscono le superfici superiore ed inferiore almeno in corrispondenza della porzione d’angolo 14. Le faccette periferiche 15A e 15B in questa forma di realizzazione circondano l’intera parte periferica dell’inserto da taglio. Le faccette periferiche 15A e 15B in questa forma di realizzazione sono di configurazione differente. Le faccette periferiche 15A e 15B si inclinano con angoli di smusso βA-βE (come illustrato dalle figg. 3A – 3E) rispetto ad un piano P che contiene la superficie superiore 11. La faccetta periferica è atta a rafforzare i taglienti dell’inserto da taglio. In questa forma di realizzazione la superficie superiore 11 è piana e collega direttamente alla faccetta periferica 15 così da permettere una configurazione resistente. Una intersezione tra la faccetta periferica 15 e la superficie di raggio in punta 14A forma un tagliente in punta 16. Il tagliente in punta 16 è definito da almeno un raggio R1. Ciascun angolo tagliente di lavoro 14 comprende almeno un bordo convesso pulente 17, 18 collegato al tagliente in punta 16. In questa forma di realizzazione si è previsto un primo 17 ed un secondo 18 bordo pulente separati dal tagliente in punta 16. La superficie di raggio in punta 14A potrebbe essere simmetrica rispetto alla bisettrice d’angolo B. Ciò porterebbe il vantaggio che l’inserto da taglio diverrebbe simmetrico, permettendo in tal modo una tornitura sinistrorsa e destrorsa con lo stesso inserto, vale a dire, si potrebbero usare per questo inserto da taglio sia portautensili sinistrorsi che destrorsi. L’inserto da taglio 10 in questa forma di realizzazione ha un foro passante 21 che si sviluppa in perpendicolare alle superfici 11 e 12.
Facendo ora riferimento in particolare alle figg. 3C e per esempio 3E, l’angolo di smusso βc in una sezione trasversale in corrispondenza del tagliente in punta 16 è superiore dell’angolo di smusso βE in una sezione trasversale lontano dal tagliente in punta 16. L’angolo di smusso βC nella sezione trasversale in corrispondenza del tagliente in punta 16 è superiore dell’angolo di smusso in una sezione trasversale in corrispondenza di detti primo 16 o secondo 18 bordi pulenti. La faccetta periferica 15A e 15B segue una linea praticamente diritta in una sezione trasversale passante per l'inserto da taglio 10, come è mostrato nelle figg. 3A-3E. La faccetta periferica 15 possiede un angolo di smusso variabile in continuo β in corrispondenza della porzione d’angolo 14. L’angolo di smusso βC, in una sezione trasversale come illustrato in fig. 3C in corrispondenza del tagliente in punta 16, è superiore dell’angolo di smusso βE in una sezione trasversale in corrispondenza del primo bordo pulente 17. La faccetta periferica 15 possiede, in una vista in pianta, una larghezza praticamente costante WA - WE, come illustrato dalle figg. 3A-3E. La larghezza della faccetta WE è tuttavia leggermente maggiore delle larghezze WA - WD. In alternativa, le larghezze della faccetta potrebbero variare similmente alle variazioni dell'angolo di smusso.
Il primo bordo pulente 17 è definito da almeno un primo raggio pulente R2 ed il secondo bordo pulente 18 è definito da almeno un secondo raggio pulente R3, detti raggi R1 - R3 avendo differenti punti di origine. I raggi R2 e R3 possono avere uguale dimensione. La faccetta periferica 15, in corrispondenza sia del primo che del secondo bordo pulente 17, 18, possiede un angolo di smusso variabile in continuo β. Facendo riferimento alle figg. 3A – 3E ed alla fig. 6A e 6B, l’angolo βA viene scelto nell’intervallo da 5 a 20°; l’angolo βB viene scelto nell’intervallo da 10 a 30°; l’angolo βC viene scelto nell’intervallo da 15 a 60°; l’angolo βD viene scelto nell’intervallo da 10 a 30°, e l’angolo βE viene scelto nell’intervallo da 5 a 20°. Per di più, l’altezza di proiezione Z dello smusso, quando vista perpendicolarmente alla superficie laterale 13A, 13B o alla superficie di raggio in punta 14A, potrebbe variare nell’intervallo descritto in fig. 6B o come segue (in mm):
A B C D E
0,004 0,009 0,01 0,009 0,004
0,18 0,29 0,86 0,29 0,18
Si faccia ora riferimento alle figg. 7A e 7B, le quali mostrano rispettivamente l’inserto da taglio durante la tornitura di un pezzo da lavoro 19 ed una porzione ingrandita dell’inserto da taglio e del pezzo da lavoro durante un duro processo di tornitura. Solitamente la profondità di taglio Y è uguale od inferiore al raggio del tagliente in punta R1, così che il materiale non tagliato non raggiunga per esempio la bisettrice B. L’inserto viene posizionato con un angolo di spoglia inferiore σ oltre il bordo pulente 17. La dimensione del truciolo 20 da rimuovere si determina con la profondità di taglio Y e l’avanzamento per rivoluzione X. Lo spessore del truciolo passa a zero in corrispondenza del bordo pulente convesso 17. Dato che la faccetta periferica 15 possiede uno smusso che è praticamente senza spigoli in corrispondenza della bisettrice della porzione d’angolo 14, quella porzione resiste all’usura mentre il bordo pulente 17, che taglia la parte sottile del truciolo, è relativamente aguzza e si ottiene una buona finezza superficiale. Il fatto che quella faccetta periferica 15, 15a, 15B in una vista in pianta abbia una larghezza praticamente costante WA – WE fornisce una minore variazione nella posizione del tagliente quando lo si usi in un portautensile.
Nella forma di realizzazione descritta l’angolo attivo dell’inserto da taglio è una sezione di CBN ed in tal modo i taglienti 16, 17 e 18 sono composti da CBN. In alternativa si potrebbe usare un qualsiasi altro materiale adatto da taglio a seconda dell’applicazione della lavorazione a macchina.
Quando si usino gli inserti da taglio aventi i bordi pulenti le forze radiali divengono elevate rispetto ai convenzionali inserti da taglio senza bordi pulenti. Un inserto da taglio secondo la presente invenzione possiede un angolo di smusso più spuntato attorno alla bisettrice del suo angolo tagliente così da proteggere l’angolo dalla rottura con elevate velocità di avanzamento, mentre il bordo pulente è meno spuntato così da diminuire le forze radiali. In questo modo si è proposto un inserto da taglio per tornitura che migliora la finezza della superficie lavorata a macchina e che incrementa in modo significativo la vita dell’utensile.
* * * * *
RIVENDICAZIONI
1. Inserto da taglio per tornitura comprendente una superficie superiore (11), una superficie inferiore (12) sostanzialmente parallela a detta superficie superiore, ed almeno tre superfici laterali (13A, 13B) che si sviluppano tra dette superfici superiore ed inferiore, una zona di transizione tra le due superfici laterali adiacenti (13A, 13B) formando una superficie di raggio in punta arrotondata (14A) in corrispondenza di un angolo dell’inserto da taglio (14), detto inserto da taglio comprendendo una faccetta periferica (15, 15A, 15B) che collega le superfici superiore e laterale almeno in corrispondenza della porzione d'angolo (14) con un angolo di smusso (βA-βE), ed una intersezione di detta faccetta (15, 15A, 15B) e di detta superficie di raggio in punta (14A) formando un tagliente in punta (16), detto tagliente in punta (16) essendo definito da almeno un raggio (R1), detto angolo tagliente comprendendo almeno un bordo ricurvo pulente (17, 18), per cui:
l’angolo di smusso (βc) in una sezione trasversale in corrispondenza del tagliente in punta (16) è superiore dell’angolo di smusso in una sezione trasversale lontano dal tagliente in punta (16) e caratterizzato dal fatto che la faccetta periferica (15, 15A, 15B) ha, in una vista in pianta, una larghezza sostanzialmente costante (WA-WE).
2. Inserto da taglio secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’angolo di smusso (βc) nella sezione trasversale in corrispondenza del tagliente in punta (16) è maggiore dell’angolo di smusso in una sezione trasversale in corrispondenza di detto bordo pulente.
3. Inserto da taglio secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che la faccetta periferica è prevista come smusso (15) che circonda l’intera parte periferica dell’inserto da taglio.
4. Inserto da taglio secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che la faccetta periferica (15, 15A, 15B) segue una linea sostanzialmente diritta in una sezione trasversale da una parte all’altra dell'inserto da taglio.
5. Inserto da taglio secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che la faccetta periferica (15, 15A, 15B) possiede un angolo di smusso variabile in continuo (β) in corrispondenza della porzione d'angolo (14).
6. Inserto da taglio secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che l’angolo di smusso (βc) in una sezione trasversale in corrispondenza del tagliente in punta (16) è maggiore dell’angolo di smusso (βE) in una sezione trasversale in corrispondenza di un primo bordo pulente (17, 18).
7. Inserto da taglio secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che l’angolo tagliente (14) comprende un primo bordo pulente che è definito da almeno un raggio (R2) ed un secondo bordo pulente che è definito da almeno un raggio (R3), detti raggi (R1 – R3) avendo differenti punti di origine.
8. Inserto da taglio secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che sia il primo che il secondo bordo pulente (17, 18) hanno un angolo di smusso variabile in continuo (β).
9. Inserto da taglio secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che l’inserto da taglio (10) è composto tutto od in parte da nitruro di boro cubico.
Da Inglese a Italiano: Long Lasting Glucagon-Like Peptide 2 (Glp-2) For The Treatment Of Gastrointestinal Diseases And Disorders (by ConjuChem Biotechnologies Inc. CA) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese Description
FIELD OF THE INVENTION
This invention relates to glucagon-like peptide 2 (GLP-2) derivatives. In particular, this invention relates to GLP-2 peptide derivatives having an extended in vivo half-life, for the treatment or prevention of gastrointestinal disorders or diseases such as inflammatory bowel disease and other gastrointestinal functions, from any segment of the gastrointestinal tract, from the oesophagus to the anus.
BACKGROUND OF THE INVENTION
GLP-2 is a 33 amino acid peptide expressed in a tissue-specific manner from the pleiotropic proglucagon gene, and thus part of the glucagon super-family of peptide hormones. Alternative post-translational processing of proglucagon occurs in pancreas, intestine and brain. Enzymatic cleavages in proglucagon produce numerous multifunctional peptide hormones involved in nutrient metabolism. The major bioactive hormones derived from proglucagon are in the pancreatic α-cells, and GLP-1 and GLP-2 in the intestinal L-cells and brain. It was first discovered to possess potent intestinotropic properties by Drucker et al. (see Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. 93, (115), 7911-7916). GLP-2, as a natural intestinal-derived peptide, has been demonstrated to have a significant reparative activity for the mucosal epithelium of the small and large intestine. It has also been demonstrated to increase the ability of the intestine to digest and absorb nutrients, suggesting a potential therapeutic role in the treatment of intestinal insufficiency. Indeed, several studies have now confirmed that GLP-2 administration reduces or prevents intestinal damage in rodent models of colitis, enteritis, total parenteral nutrition and massive resection. Very recently, phase 2 clinical trials of GLP-2 have also been reported, in which patients with short bowel syndrome were demonstrated to exhibit an enhanced ability to absorb enteral nutrients after 30 days of GLP-2 administration, with apparently no undesirable side effects.
The principal metabolic pathway for GLP-2 clearance is through enzymatic degradation. GLP-2 has been shown to be rapidly degraded through the removal of its two N-terminal amino acids by dipeptidylpeptidase-IV (DPP-IV), which represents a major limitation because it leads to the complete inactivation of the peptide. As a result, the half-life of GLP-2 is thus quite short, and current GLP-2 treatment necessitates infusion or frequent injections. Renal clearance has also been shown to be involved in the clearance of GLP-2. The major action of GLP-2 involves stimulation of cell growth, and the mechanism coupling GLP-2 receptor activation, directly or indirectly, to cell proliferation has not been examined.
It has been shown that peptide analogs of native GLP-2 possess enhanced trophic activity at the small intestine as GLP-2 receptor agonists (see for example US 5,990,077).
Although very useful, a critical disadvantage of GLP-2 peptides and analogs, as stated above, is their very short half-lives in vivo, which is typically not more than 2 minutes.
Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a group of chronic disorders that cause inflammation or ulceration in the small and large intestines. It may even be life threatening, and there is currently no known cure. IBD commonly refers to ulcerative colitis (UC), limited to the colon and Crohn's disease (CD) which can involve the entire gastrointestinal tract, resulting in a chronic cycle of remissions and flares. Many pharmaceutical products are known to treat IBD, for example to suppress inflammation, to prevent flare-ups, to control symptoms such as pain or diarrhea, or to replace or supplement essential nutrients that are poorly absorbed because of extensive disease or surgery. Current treatment options include a wide variety of pharmaceutical products like aminosalicylates, corticosteroids, immune modulators, and anti-TNF-α agent, and are designed to reduce inflammation and relieve symptoms in addition to replacing lost fluids and nutrients. Most of these products however have a limited use in IBD because of their undesirable side effects on the body in general.
Approximately one million patients are treated for IBD every year in the United States and Europe, most of them generally suffering from either Crohn's disease or ulcerative colitis, In fact, it is not uncommon for subjects suffering from IBD to undergo radical surgery involving the removal of major parts of the intestine. Direct annual healthcare costs of IBD are approximately $US 700 million, and the total economic impact of both direct and indirect costs approximate between $2 and $3 billion a year worldwide. Existing treatments, while often providing relief, have some shortcomings.
US 5,789,379 teaches GLP-2 analogs among which one has been developed as a long-acting compound (ALX-600™) and is currently in clinical trials. However, even if DPP-IV degradation of GLP-2 appears to be somehow prevented, its half-life remains limited by renal clearance, and does not exceed 2 minutes, as stated above.
A chimeric antibody (Remicade™ has been developed to bind specifically to human tumor necrosis factor alpha (TNF-α) for the short-term treatment of Crohn's. This antibody is indicated for the reduction of the symptoms of moderate to severe Crohn's disease in patients who have had an inadequate response to conventional therapy with corticosteroids, other immunosuppressants and/or antibiotics. Nevertheless, serious side effects are observed with such treatment. For example, it has been associated with hypersensitivity reaction, serious infections including sepsis, as well as fatal infections. Its administration could further predispose patients to infections through TNF-blocking.
With the prevalence of IBD increasing in recent years, it would therefore be highly desirable to develop GLP-2 peptide derivatives or analogs capable of substantially maintaining the same level of activity, low toxicity and therapeutic advantages as GLP-2, but with a much longer in vivo half-life, thus avoiding the necessity for continuous administration thereof in the treatment of various diseases such as inflammatory bowel disease, Crohn's disease and ulcerative colitis representing the two major inflammatory bowel diseases.
WO 00/69900 describes protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components.
SUMMARY OF THE INVENTION
In accordance with the present invention, there is now provided a GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative having an extended in vivo half-life when compared with the corresponding unmodified GLP-2 gastrointestinal growth promoter. The present invention provides a gastrointestinal tissue growth promoter derivative selected from the group consisting of:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2; and His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH2
where MPA is maleimidopropionic acid and AEEA is 2-[2-(2-amino)ethoxy] ethoxy acetic acid. The GLP-2 derivative comprises a reactive entity (MPA) coupled thereto and capable of reacting with available functionalities on a blood component, either in vivo or ex vivo, to form a stable covalent bond. The covalent bonding formed between the GLP-2 derivative and the blood component prevents undesirable cleavage of the GLP-2 by enzymes such as dipeptidylpeptidase IV, thereby extending its in vivo half-life and activity.
Preferred blood components comprise proteins such as immunoglobulins, including IgG and IgM, serum albumin, ferritin, steroid binding proteins, transferrin, thyroxin binding protein, α-2-macroglobulin, haptoglobin etc., serum albumin and IgG being more preferred, and serum albumin being the most preferred.
The reactive entity, maleimidopropionic acid (MPA), is capable of forming a covalent bond with the blood component by reacting with thiol groups present thereon, either in vivo or in vitro (or ex vivo).
In another aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the present GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Such composition is useful for the treatment or prevention of bowel disorders or diseases such as inflammatory bowel disease and other gastrointestinal functions. The composition may also be used for gene therapy to induce cells to endogenously produce the gastrointestinal tissue growth promoter peptide derivative that may then be implanted in a subject to produce the desired biological effect. Finally, the composition may also be used for manufacturing pharmaceutical or veterinary compositions for the enhancement of large intestine tissue growth.
In a further embodiment of the present invention, there is provided the present GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative or a conjugate thereof for use in the treatment or prevention of bowel disorders or diseases such as inflammatory bowel disease, and gastrointestinal functions in a subject, preferably a mammal, animal or human.
In a further aspect of the present invention, there is provided a conjugate comprising the present GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative covalently bonded to a blood component.
A method is described for extending the in vivo half-life of a GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter in a subject, the method comprising covalently bonding the GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative to a blood component. The covalent bonding may take place in vivo or in vitro.
The gastrointestinal tissue growth promoter compounds are peptides which are GLP-2 analogs which possesses gastrointestinal tissue growth promoting activity. Details of the sequences of these analogs are illustrated below.
A further use of the present compound derivative may be the determination of the intestinotrophic activity of a hormone when used in combination with the present compound derivative, and particularly when the compound is a GLP-2 analog or a GLP-2 fragment. Such method comprises the steps of: (a) coadministering the hormone with an intestinotrophic amount of the GLP-2 derivative to a test subject; (2) assessing the subsequent growth of small and large intestine tissue in the test subject; and (3) determining whether the growth of small and/or large intestine tissue in the test subject is enhanced relative to control subjects treated with unmodified GLP-2 analog or GLP-2 derivative.
If a linking group is present, it is 2-[2-(2-amino)ethoxy]ethoxy acetic acid, AEEA.
IN THE DRAWINGS
Figure 1 illustrates the changes in small intestine wet weight in mice treated with saline or 5 µg of the compounds of Examples 1-8 twice daily, for 10 days (n = 10/group). Results are expressed as mean delta weight vs. control ± SEM.
Figure 2 illustrates changes in small intestine and large intestine wet weight in mice treated with saline or 5, 25 or 50 µg of the compounds of Examples 5, 7 and 8, twice daily, for 10 days (n =10/group). Results are expressed as mean weight ± SEM.
Figure 3 illustrates the mean plasma concentrations for the compounds of Examples 5 and 8 in Sprague-Dawley rats following a single 500 nmol/kg intravenous or subcutaneous dose (n = 4 / group).
Figure 4 illustrates detection of the compound of Example 8 conjugated to rat plasma proteins using a polyclonal antibody anti-GLP-2 antibody and comparison to the pattern obtained with an anti-rat albumin.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In vivo bioconjugation is the process of covalently bonding a molecule, such as the present gastrointestinal tissue growth promoter compound derivative, within the body, to target blood components, preferably proteins, in a manner that permits the substantial retention, or increase in some instances, of the biological activity of the original unmodified GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter peptide therein, while providing an extended duration of the biological activity though giving the GLP-2 derivative the biophysical parameters of the target blood component,
For the purposes of the present invention, the terms "analog" or "fragment" are meant to include amino acid sequences comprising peptides with different amino acid sequences from the native sequence, such as the GLP-2 sequence, but with similar or comparable activity. Such analogs preferably have an amino acid sequence at least 60%, and more preferably at least 80%, and most preferably at least 95% the same as that of either GLP-2 or a fragment of GLP-2 having the same number of amino acid residues.
The present gastrointestinal tissue growth promoter peptide derivative comprise a GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter peptide that has been modified by coupling thereto a reactive entity, either directly or via a linking group, the reactive entity being capable of forming a covalent bond with a blood component, preferably blood proteins. The reactive entity is stable in an aqueous environment, and is MPA. The covalent bond is formed between the reactive entity and a thiol group on the blood component. The preferred blood component comprises mobile blood components like serum albumin, immunoglobulins, or combinations thereof. In a most preferred embodiment, the blood component is serum albumin.
The blood components are preferably mobile, which means that they do not have a fixed situs for any extended period of time, generally not exceeding 5 minutes, and more usually one minute. These blood components are not membrane-associated and are present in the blood for extended periods of time in a minimum concentration of at least 0.1 µg/mL Preferred mobile blood components include serum albumin, transferrin, ferritin and immunoglobulins such as IgM and IgG. The half-life of mobile blood components is at least about 12 hours.
The present gastrointestinal tissue growth promoter derivative is a GLP-2 peptide, and therefore protective groups may be required during the synthesis process of the GLP-2 derivative. These protective groups are conventional in the field of peptide synthesis, and can be generically described as chemical moieties capable of protecting the peptide derivative from reacting with other functional groups. Various protective groups are available commercially, and examples thereof can be found in US 5,493,007 which is hereby incorporated by reference. Typical examples of suitable protective groups include acetyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), t-butyloxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ), etc. Table 1 provides both the three letter and one letter abbreviations for amino acids.
TABLE 1
NATURAL AMINO ACIDS AND THEIR ABBREVIATIONS
Name 3-letter abbreviation 1-letter abbreviation
Alanine Ala A
Arginine Arg R
Asparagine Asn N
Aspartic acid Asp D
Cysteine Cys C
Glutamic acid Glu E
Glutamine Gln Q
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Ile I
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Methionine Met M
Phenylalanine Phe - F
Proline Pro P
Serine Ser S
Threonine Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V
The GLP-2 derivative forms a peptidase-stabilized peptide after conjugation to a blood component, an albumin. It is also contemplated that one or more additional amino acids may be added or substituted to the peptide prior to addition of the reactive entity, to facilitate the coupling thereof to the peptide. Such addition or substitution may be made at the N-terminal, the C-terminal, or therebetween. The thus obtained peptide derivative may be administered to a subject, animal or human, such that conjugation with blood components occurs in vivo, or they may be first conjugated to blood components of the subject, animal or human, in vitro, and the resulting conjugate, or peptidase-stabilized peptide as defined below, administered to the subject
Any amino acid, present, substituted with or added to, the GLP-2 sequence, may be D-amino acids or L-amino acids or combinations thereof. L-amino acids are generally preferred. The derivatives of the present invention have a glycine substitution at position 2 of the native GLP-2 sequence because it confers to the analog a greater resistance to DPP-IV enzyme.
A peptidase-stabilized GLP-2 derivative is more stable in the presence of peptidases in vivo than the corresponding non-stabilized GLP-2 analog. The peptidase stability is determined by comparing the half-life of the native GLP-2 analog in serum or blood to the half-life of the corresponding derivative containing the reactive entity in serum or blood. Half-life is determined by sampling the serum or blood after administration of the derivative and the non-modified peptide, and determining the activity of each compound.
In greater details, the present invention is directed to the modification of GLP-2 and analogs and fragments thereof to improve its bioavailability, extend in vivo half-life and distribution through selective conjugation onto a blood component while substanitally maintaining or improving their remarkable therapeutic properties.
Human GLP-2 is known to have the following sequence:
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Tbr-Lys-Ile-Thr-Asp.
The invention relates to therapeutic and related uses of GLP-2 derivatives having an extended half-life invivo, particularly to
promote the growth of small and/or large intestine tissue;
elevate blood levels of GLP-2 derivative;
restore or maintain gastrointestinal function;
promote the healing and regrowth of injured or ulcerated/inflamed intestinal mucosa;
reduce the risk of enteric disease;
enhance the nutritional status;
treat or prevent nutritional or gastrointestinal disorders or diseases;
reduce weight loss;
reduce interleukin-1 expression;
increase colon length,both mucosal area and integrity in the colon, and crypt depth;
promote villous growth in subjects suffering from a disease such as celiac disease, post-infectious villous atrophy and short gut syndromes;
promote proliferation of the small and large intestine in a healthy subject, for example to enable increased absorption of nutrients in cattle allowing earlier weaning or increased milk and meat production; etc.
The effect on growth elicited by the present GLP-2 derivatives manifests as an increase in small bowel weight, relative to a mock-treated control. In particular, the present GLP-2 derivatives are considered to have "intestinotrophic" activity if, when assessed in the murine model exemplified herein, the analog mediates an increase in small bowel weight of at least 10% relative to a control animal receiving vehicle alone. Particularly suitable for therapeutic use are those derivatives which mediate an increase of at least 20% in small bowel weight, while those more preferred mediate an increase in small bowel weight of 50% or more. Intestinotrophic activity is noted most significantly in relation to the jejunum, including the distal jejunum and particularly the proximal jejunum, and is also noted in the ileum.
In addition to exhibiting intestinotrophic activity, the present GLP-2 derivatives incorporate an amino acid substitution within a GLP-2 peptide "backbone", which is a variant of a mammalian GLP-2 species in which the C-terminus has been altered by addition of a basic residue. Thus, the present peptide derivatives incorporate a lysine residue added at the C-terminal of the GLP-2 peptide sequence.
The functionality on the protein will be a thiol group and the reactive entity will be the maleimido-containing group, maleimidopropionic acid (MPA), or 2-[2-(2-amino)ethoxy)] ethoxy acetic acid (AEEA)-MPA.
Maleimide groups are most selective for sulfhydryl groups on peptides when the pH of the reaction mixture is kept between 6.5 and 7.4. At pH 7.0, the rate of reaction of maleimido groups with sulfhydryls is 1000-fold faster than with amines. A stable thioether linkage between the maleimido group and the sulfhydryl is formed which cannot be cleaved under physiological conditions.
The gastrointestinal tissue growth promoter derivatives of the invention provide for specific labeling of blood components. Such specific labeling, particularly with a maleimide, offers several advantages. Free thiol groups are less abundant in vivo than amino groups, and as a result, maleimide derivatives covalently bond to fewer proteins. For example, in serum albumin, there is only one free thiol group per molecule. Thus, a GLP-2 - maleimide - albumin conjugate will tend to comprise a 1:1 molar ratio of peptide to albumin. In addition to albumin, IgG molecules (class II) also have free thiols. Since IgG molecules and serum albumin make up the majority of soluble proteins in the blood, i.e., 99%, they also make up the majority of the free thiol groups available to covalently bond to a maleimide-substituted GLP-2.
Further, even among free thiol-containing blood proteins, specific labeling with a maleimide leads to the preferential formation of peptide maleimide-albumin conjugates, - due to the unique characteristics of albumin itself. The single free thiol group of albumin, highly conserved among species, is located at amino acid residue Cys34. It has been demonstrated recently that the Cys34 of albumin has an increased reactivity relative to free thiols on other free thiol-containing proteins. This is due in part to the unusual pK value of 5.5 for the Cys34 of albumin. This is much lower than typical pK values for cysteines residues in general, which are typically about 8. Due to this low pK, under normal physiological conditions, Cys34 of albumin is predominantly in the anionic form, which dramatically increases its reactivity. In addition to the low pK value of Cys34, another factor which enhances the reactivity of Cys34 is its location, which is in a hydrophobic pocket close to the surface of one loop of region V of albumin. This location makes Cys34 accessible to ligands of all kinds, and is an important factor in Cys34 biological role as free radical trap and free thiol scavenger. As a result, the reaction rate acceleration can be as much as 1000-fold relative to rates of reaction of peptide-maleimides with other free-thiol containing proteins.
Another advantage of peptide-maleimide-albumin conjugates is the reproducibility associated with the 1:1 loading of peptide to albumin specifically at Cys34. Conventional activation techniques, such as with glutaraldehyde, DCC, EDC and other chemical activators of, for example, free amines, lack this selectivity. For example, albumin contains 52 lysine residues, 25-30 of which are located on the surface of albumin and accessible for conjugation. Activating these lysine residues, or alternatively modifying a peptide to couple through these lysine residues, results in a heterogeneous population of conjugates. Even if an equimolar ratio peptide:albumin (i.e., 1:1) is employed, the end result is the production of random conjugation products, some containing an indefinite number of peptides linked to each molecule of albumin, and each conjugate having peptides randomly coupled at any one of the 25-30 available lysine sites. Consequently, characterization of the exact composition is virtually impossible, not to mention the absence of reproducibility. Additionally, while it would seem that conjugation through lysine residues of albumin would at least have the advantage of delivering more therapeutic agent per albumin molecule, studies have shown that a 1:1 ratio of therapeutic agent to albumin is preferred. In an article by Stehle, et al. in Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685, it is reported that a 1:1 ratio of the anti-cancer methotrexate to albumin conjugated via glutaraldehyde gave the most promising results. These conjugates were taken up by tumor cells, whereas conjugates bearing 5:1 to 20:1 methotrexate molecules had altered HPLC profiles and were quickly taken up by the liver in vivo. It would therefore seems that at higher ratios, the effectiveness of albumin as a carrier for a therapeutic agent is diminished.
Through controlled administration of the present GLP-2 peptide derivative, and particularly a GLP-2 peptide comprising a maleimide reactive entity, specific in vivo labeling or bonding of albumin and IgG can be controlled. In typical administrations, it has been shown that 80-90% of the administered peptide derivative bonds to albumin and less than 5% bonds to IgG. Trace bonding of free thiols present, such as glutathione, also occurs. Such specific bonding is preferred for in vivo use as it permits an accurate calculation of the estimated half-life of the therapeutic agent administered.
Maleimide-substituted GLP-2 peptides are generally quite stable in the presence of aqueous solutions and in the presence of free amines. Because maleimide-substituted GLP-2 peptides react with free thiols, protective groups are not necessary to prevent them from reacting with themselves.
As stated above, the desired conjugates of GLP-2 derivatives to blood components may be prepared in vivo by administration of the derivatives directly to the subject, which may be an animal or a human. The administration may be done in the form of a bolus, or introduced slowly over time by infusion using metered flow or the like.
Alternately, the conjugate may also be prepared ex vivo by combining blood or commercially available purified blood components with the present GLP-2 derivative, allowing covalent bonding of the GLP-2 derivative to the functionalities on blood components, and then returning or administering the conjugated blood or conjugated purified blood component to the host. Moreover, the above may also be accomplished by first purifying an individual blood component or limited number of components, such as red blood cells, immunoglobulins, serum albumin, or the like, and combining the component or components ex vivo with the present compound derivative. The labeled blood or blood component may then be returned to the subject to provide in vivo the therapeutically effective conjugates. The blood also may be treated to prevent coagulation during handling ex vivo.
Peptide Synthesis
GLP-2 peptides may be synthesized by standard methods of solid phase peptide chemistry well known to any one of ordinary skill in the art. For example, the peptide may be synthesized by solid phase chemistry techniques following the procedures described by Steward et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984.) using a Rainin PTI Symphony™ synthesizer. Similarly, peptides fragments may be synthesized and subsequently combined or linked together to form a larger peptide (segment condensation). These synthetic peptide fragments can also be made with amino acid substitutions and/or deletion at specific locations.
For solid phase peptide synthesis, a summary of the many techniques may be found in Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 and Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 1973, 2 46. For classical solution synthesis, see for example Schroder et al. in "The Peptides", volume 1, Acacemic Press (New York). In general, such method comprises the sequential addition of one or more amino acids or suitably protected amino acids to a growing peptide chain on a polymer. Normally, either the amino or carboxyl group of the first amino acid is protected by a suitable protecting group. The protected and/or derivatized amino acid is then either attached to an inert solid support or utilized in solution by adding the next amino acid in the sequence having the complimentary (amino or carboxyl) group suitably protected and under conditions suitable for forming the amide linkage. The protecting group is then removed from this newly added amino acid residue and the next amino acid (suitably protected) is added, and so forth.
After all the desired amino acids have been linked in the proper sequence, any remaining protecting groups (and any solid support) are cleaved sequentially or concurrently to afford the final peptide. By simple modification of this general procedure, it is possible to add more than one amino acid at a time to a growing chain, for example, by coupling (under conditions which do not racemize chiral centers) a protected tripeptide with a properly protected dipeptide to form, after deprotection, a pentapeptide (segment condensation).
A particularly preferred method of preparing the present GLP-2 derivatives involves solid phase peptide synthesis wherein the amino acid α-N-terminal is protected by an acid or base sensitive group. Such protecting groups should have the properties of being stable to the conditions of peptide linkage formation while being readily removable without destruction of the growing peptide chain or racemization of any of the chiral centers contained therein. Examples of N-protecting groups and carboxy-protecting groups are disclosed in Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, New York pp. 152-186 (1981)), Examples of N-protecting groups comprise, without limitation, loweralkanoyl groups such as formyl, acetyl ("Ac"), propionyl, pivaloyl, t-butylacetyl and the like; other acyl groups include 2-chloroacetyl, 2-bromoacetyl, trifluoroacetyl, trichloroacetyl, phthalyl, o-nitrophenoxyacetyl, -chlorobutyryl, benzoyl, 4-chlorobenzoyl, 4-bromobenzoyl, 4-nitrobenzoyl and the like; sulfonyl groups such as benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, o-nitrophenylsulfonyl, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), and the like; carbamate forming groups such as t-amyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, p-chlorobenzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-ethoxybenzyloxycarbonyl, 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α,α-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, benzhydryloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl (boc), diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, methoxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2,-trichloroethoxycarbonyl, phenoxycarbonyl, 4-nitrophenoxycarbonyl, fluorenyl-9-methoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, phenylthiocarbonyl and the like; arylalkyl groups such as benzyl, biphenylisopropyloxycarbonyl, triphenylmethyl, benzyloxymethyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and the like and silyl groups such as trimethylsilyl and the like. Preferred α-N-protecting group are o-nitrophenylsulfenyl; 9-fluorenylmethyloxycarbonyl; t-butyloxycarbonyl (boc), isobornyloxycarbonyl; 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl; t-amyloxycarbonyl; 2-cyano-t-butyloxycarbonyl, and the like, 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl (Fmoc) being more preferred, while preferred side chain N-protecting groups comprise 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), nitro, p-toluenesulfonyl, 4-methoxybenzene-sulfonyl, Cbz, Boc, and adamantyloxycarbonyl for side chain amino groups like lysine and arginine; benzyl, o-bromobenzyloxycarbonyl, 2,6-dichlorobenzyl, isopropyl, t-butyl (t-Bu), cyclohexyl, cyclopenyl and acetyl (Ac) for tyrosine; t-butyl, benzyl and tetrahydropyranyl for serine; trityl, benzyl, Cbz, p-toluenesulfonyl and 2,4-dinitrophenyl for histidine; formyl for tryptophan; benzyl and t-butyl for asparticacid and glutamic acid; and triphenylmethyl (trityl) for cysteine.
A carboxy-protecting group conventionally refers to a carboxylic acid protecting ester or amide group. Such carboxy protecting groups are well known to those skilled in the art, having been extensively used in the protection of carboxyl groups in the penicillin and cephalosporin fields as described in US 3,840,556 and3,719,667. Representative carboxy protecting groups comprise, without limitation, C1-C8 loweralkyl; arylalkyl such as phenethyl or benzyl and substituted derivatives thereof such as alkoxybenzyl or nitrobenzyl groups; arylalkenyl such as phenylethenyl; aryl and substituted derivatives thereof such as 5-indanyl; dialkylaminoalkyl such as dimethylaminoethyl; alkanoyloxyalkyl groups such as acetoxymethyl, butyryloxymethyl, vateryloxymethyl, isobutyryloxymethyl, isovaleryloxymethyl, 1-(propionyloxy)-1-ethyl, 1-(pivaloyloxyl)-1-ethyl, 1-methyl-1-(propionyloxy)-1-ethyl, pivaloyloxymethyl, propionyloxymethyl; cycloalkanoyloxyallcyl groups such as cyclopropylcarbanyloxymethyl, cyclobutylearbonyloxymethyl, cyclopentylcarbonyloxymethyl, cyclohexytcarbonyloxymethyl; aroyloxyalkyl such as benzoyloxymethyl, benzoyloxyethyl; arylalkylcarbonyloxyalkyl such as benzylcarbonyloxymethyl, 2-benzylcarbonyloxyethyl; alkoxycarbonylalkyl or cycloalkyloxycarbonylalkyl such as methoxycarbonylmethyl, cyclohexyloxycarbonylmethyl, 1-methoxycarbonyl-1-ethyl; alkoxycarbonyloxyalkyl or cycloalkyloxycarbonyloxyalkyl such as methoxycarbonyloxymethyl, t-butyloxycarbonyloxymethyl, 1-ethoxycarbonyloxy-1-ethyl, 1-cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl; aryloxycarbonyloxyalkyl such as 2-(phenoxycarbonyloxy)ethyl, 2-(5-indanyloxycarbonyloxy)-ethyl; alkoxyalkylcarbonyloxyalkyl such as 2-(1-methoxy-2-methylpropan-2-oyloxy)-ethyl; arylalkyloxycarbonyloxyalkyl such as 2-(benzyloxycarbonyloxy)ethyl; arylalkenyloxycarbonyloxyalkyl such as 2-(3 phenylpropen-2-yloxycarbonyloxy)ethyl; alkoxycarbonylaminoalkyl such as t-butyloxycarbonylaminomethyl; alkylaminocarbonylaminoalkyl such as methylaminocarbonylaminomethyl; alkanoylaminoalkyl such as acetylaminomethyl; heterocycliccarbonyloxyalkyl such as 4-methylpiperazinylcarbonyloxymethyl; dialkylaminocarbonylalkyl such as dimethylaminocarbonylmethyl, diethylaminocarbonylmethyl; (5-(loweralkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl such as (5-t-butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl; and (5-phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl such as (5-phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl. Representative amide carboxy protecting groups comprise, without limitation, aminocarbonyl and loweralkylaminocarbonyl groups. Of the above carboxy-protecting groups, loweralkyl, cycloalkyl or arylalkyl ester, for example, methyl ester, ethyl ester, propyl ester, isopropyl ester, butyl ester, sec-butyl ester, isobutyl ester, amyl ester, isoamyl ester, octyl ester, cyclohexyl ester, phenylethyl ester and the like or an alkanoyloxyalkyl, cycloalkanoyloxyalkyl, aroyloxyalkyl or an arylalkylcarbonyloxyalkyl ester are preferred. Preferred amide carboxy protecting groups are loweralkylaminocarbonyl groups.
In the solid phase peptide synthesis method, the α-C-terminal amino acid is attached to a suitable solid support or resin. Suitable solid supports useful for the above synthesis are those materials that are inert to the reagents and reaction conditions of the stepwise condensation-deprotection reactions, as well as being insoluble in the media used. The preferred solid support for synthesis of α-C-terminal carboxy peptides is 4-hydroxymethylphenoxyacetyl-4'-methylbenzyhydrylamine resin (HMP resin). The preferred solid support for α-C-terminal amide peptides Fmoc-protected Ramage Resin.
When the solid support is 4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxy-acetamidoethyl resin, the Fmoc group is cleaved with a secondary amine, preferably piperidine, prior to coupling with the α-C-terminal amino acid as described above. The preferred method for coupling to the deprotected 4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-acetamidoethyl resin is O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphate (HBTU, 1 equiv.), diisopropylethylamine (DIEA, 1 equiv.), and optionally 1-hydroxybenzotriazole (HOBT, 1 equiv.), in DMF. The coupling of successive protected amino acids can be carried out in an automatic polypeptide synthesizer in a conventional manner as is well known in the art.
The removal of the Fmoc protecting group from the α-N-terminal side of the growing peptide is accomplished conventionally, for example, by treatment with a secondary amine, preferably piperidine. Each protected amino acid is then introduced in about 3-fold molar excess, and the coupling is preferably carried out in DMF. The coupling agent is normally O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate (HBTU, 1 equiv.), diisopropylethylamine (DIEA, 1 equiv.), and optionally 1-hydroxybenzotriazole (HOBT, 1 equiv.).
At the end of the solid phase synthesis, the peptide is removed from the resin and deprotected, either in successive operations or in a single operation. Removal of the polypeptide and deprotection can be accomplished conventionally in a single operation by treating the resin-bound polypeptide with a cleavage reagent comprising thioanisole, triisopropylsilane, phenol, and trifluoroacetic acid. In cases wherein the α-C-terminal of the polypeptide is an alkylamide, the resin is cleaved by aminolysis with an alkylamine. Alternatively, the peptide may be removed by transesterification, e.g. with methanol, followed by aminolysis or by direct transamidation. The protected peptide may be purified at this point or taken to the next step directly. The removal of the side chain protecting groups is accomplished using the cleavage mixture described above. The fully deprotected peptide can be purified by a sequence of chromatographic steps employing any or all of the following types: ion exchange on a weakly basic resin (acetate form); hydrophobic adsorption chromatography on underivatized polystyrene-divinylbenzene (such as Amberlite XAD™); silica gel adsorption chromatography; ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose; partition chromatography, e.g. on Sephadex G-25™, LH-20™ or countercurrent distribution; high performance liquid chromatography (HPLC), especially reverse-phase HPLC on octyl- or octadecylsilyl-silica bonded phase column packing. Anyone of ordinary skill in the art will be able to determine easily what would be the preferred chromatographic steps or sequences required to obtain acceptable purification of the GLP-2 peptide.
Molecular weights of these peptides are determined using Quadrupole Electro Spray mass spectroscopy.
The synthesis process for the production of the GLP-2 derivatives of the present invention will vary widely, depending upon the nature of the various elements, i.e., the GLP-2 sequence, the linking group and the reactive entity, comprised in the GLP-2 derivative. The synthetic procedures are selected to ensure simplicity, high yields and repetitivity, as well as to allow for a highly purified product. Normally, the chemically reactive entity will be coupled at the last stage of the synthesis, for example, with a carboxyl group, esterification to form an active ester. Specific methods for the production of the present GLP-2 derivatives are described below.
It is imperative that the chemically reactive entity be placed at a site to allow the peptide to covalently bond to the blood component while retaining a substantial proportion, if not all, activity and/or beneficial effects of the corresponding native GLP-2 peptide.
The GLP-2 derivatives can be administered to patients that would benefit from growth of the tissue of the upper gastrointestinal tract. In addition, patients who would benefit from increased upper gastrointestinal tract tissue function, whether as a result of increased tissue growth or not, are candidates for treatment with the invention. In general, patients who would benefit from either increased upper gastrointestinal tract mass and/or increased upper gastrointestinal tract mucosal function are candidates for treatment with the present GLP-2 peptide derivatives. Particular conditions that may be treated with the present GLP-2 peptide derivatives include the various forms of inflammatory diseases of the stomach or esophagus, as well as patients who have undergone partial or sub-total resection of the upper gastrointestinal tract. A non-exhaustive list of conditions of the upper gastrointestinal tract including the stomach and esophagus, that may be treated by the present GLP-2 derivatives or mixtures thereof, comprises disorders of the stomach like acute gastritis, acute hemorrhagic gastritis, acute stress gastritis, viral gastritis, parasitic gastritis, fungal gastritis, gastropathy (acute), hemorrhagic gastropathy, acute helicobacter pylori gastritis, type A, B or C gastritis, hypersecretory gastritis, non specific gastritis secondary to Helicobacter pylori, Helicobacterpylori-associated gastritis, chemical gastritis, reactive gastritis, reflux gastritis, bile gastritis, metaplastic atrophic gastritis and environmental metaplastic atrophic gastritis, idiopathic pangastritis, diffuse corporal gastritis, autoimmune chronic gastritis and autoimmune-associated gastritis, bacterial gastritis other than helicobacter pilori (Gastrospirillum hominis, phlegmonous, mycobacterial, syphiltic), postantrectomy atrophic gastritis, eosinophilic gastritis, and any other acute infectious gastritis; Crohn's disease, sarcoidosis, isolated granulomatous gastritis, lymphocylic gastritis, Menetriere's disease, etc., and disorders of the esophagus like infectious esophagitis from fungi like Candida species (esp. albicans), Aspargillus sp., Histoplasma capsulatwn, Blastomyces dermatitides, or from viruses like herpes simplex virus (type 1), cytomegalovirus, Varicella-zoster virus, or from bacteria like Mycobacterium tuberculosis, Actinomyces Israelii, Streptococcus viridans, Lactobacillus acidophilus, and Treponema pallidum. Other disorders of the esophagus include, without limitation, non-infectious esophagitis, acid reflux, bile reflux, chemical injury (caused by medicines, toxins, acids, alkali etc.), sarcoidosis, Crohn's disease, Behcet's disease, Graft-versus-host disease, AIDS Related Infections (Cryptosporidium sp., Microsporidium sp., Isospora beill, Glardia Lamblia, Salmonella sp., Shigella sp., Campylobacter sp., Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Clostridium difficile, Cytomeglavorius and Herpes simplex.
Other diseases or conditions that can be treated with the present GLP-2 peptide derivatives include abnormalities in the small intestinal tract mucosa, which include ulcers and inflammatory disorders; congenital or acquired digestion and absorption disorders including malabsorption syndromes; and diseases and conditions caused by loss of small intestine mucosal function particularly in patients undergoing extended parenteral feeding or who, as a result of surgery, have undergone resection of the small intestine and suffer from short-gut syndrome and cul-de-sac syndrome. In general, patients who would benefit from either increased small intestinal mass and consequent increased small intestine mucosal function are candidates for treatment with GLP-2 peptide derivatives. Particular conditions that may be treated with the present GLP-2 derivatives include the various forms of sprue including celiac sprue which results from a toxic reaction to gliadin from wheat, and is marked by a tremendous loss of villae of the small intestine; tropical sprue which results from infection and is marked by partial flattening of the villae; hypogammaglobulinemic sprue which is observed commonly in patients with common variable immunodeficiency or hypogammaglobulinemia and is marked by significant decrease in villus height Other conditions that may be treated with the present derivatives, or for which they may be useful prophylactically, include radiation enteritis, infectious or post-infectious enteritis, regional enteritis (Crohn's disease), small intestinal damage due to toxic or other chemotherapeutic agents, and patients with short bowel syndrome.
In another aspect, patient candidates for treatment with the present GLP-2 peptide derivatives are those who would benefit from growth of pancreatic islets, and particularly from proliferation or regeneration of pancreatic islets. Such patients include those suffering from diseases or conditions marked by the absence or reduction of pancreatic islets or by reduced pancreatic islet function. Particular patient candidates are those suffering from type 1 or type 2 diabetes, as well as patients with secondary forms of diabetes due to infiltration, inflammation or destruction of the pancreas.
The present GLP-2 derivatives may be used alone or in combination to optimize their therapeutic effects. They can be administered in a physiologically acceptable medium, e.g. deionized water, phosphate buffered saline (PBS), saline, aqueous ethanol or other alcohol, plasma, proteinaceous solutions, mannitol, aqueous glucose, alcohol, vegetable oil, or the like. Other additives which may be included include buffers, where the media are generally buffered at a pH in the range of about 5 to 10, where the buffer will generally range in concentration from about 50 to 250 mM, salt, where the concentration of salt will generally range from about 5 to 500 mM, physiologically acceptable stabilizers, and the like. The compositions may be lyophilized for convenient storage and transport.
The present peptide derivatives may be administered orally, parenterally, such as intravascularly (IV), intraarterially (IA), intramuscularly (IM), subcutaneously (SC), or the like. Administration may in appropriate situations be by transfusion. In some instances, where reaction of the functional group is relatively slow, administration may be oral, nasal, rectal, transdermal or aerosol, where the nature of the conjugate allows for transfer to the vascular system. Usually a single injection will be employed although more than one injection may be used, if desired The peptide derivative may be administered by any convenient means, including syringe, trocar, catheter, or the like. The particular manner of administration will vary depending upon the amount to be administered, whether a single bolus or continuous administration, or the like. Preferably, the administration will be intravascularly, where the site of introduction is not critical to this invention, preferably at a site where there is rapid blood flow, e.g., intravenously, peripheral or central vein. Other routes may find use where the administration is coupled with slow release techniques or a protective matrix. The intent is that the peptides be effectively distributed in the blood, so as to be able to react with the blood components. The concentration of the conjugate will vary widely, generally ranging from about 1 pg/ml to 50 mg/ml. Typically, the total administered intravascularly may generally be in the range of about 0.1 mg/ml to about 10 mg/ml, more usually about 1 mg/ml to about 5 mg/ml.
By bonding to long-lived components of the blood, such as immunoglobulin, serum albumin, red blood cells and platelets, a number of advantages ensue. The activity of the present GLP-2 derivatives is extended for days, and potentially up to weeks. Only one administration needs to be given during this period of time. Greater specificity can be achieved, since the active compound will be primarily bonded to large molecules, where it is less likely to be taken up intracellularly to interfere with other physiological processes.
The blood of the mammalian host may be monitored for the activity of GLP-2 and/or presence of the GLP-2 derivatives. By taking a blood sample from the host at different times, one may determine whether the GLP-2 peptide has become bonded to the long-lived blood components in sufficient amount to be therapeutically active and, thereafter, the level of GLP-2 in the blood. If desired, one may also determine to which of the blood components the GLP-2 peptide is covalently bonded. For specific maleimide-substituted peptides, it is much simpler to calculate the half-life of serum albumin and IgG. Monitoring may also take place by using assays of peptide activity, HPLC-MS or antibodies directed to peptides.
Methods are described for determining the concentration of the GLP-2 peptide or its conjugate in biological samples (such as blood) using antibodies specific to the GLP-2 peptide and to the use of such antibodies as a treatment for toxicity potentially associated with such GLP-2 peptide or conjugate. This is advantageous because the increased stability and life of the GLP-2 peptide in vivo in the patient might lead to novel problems during treatment, including increased possibility for toxicity. The use of anti-GLP-2 antibodies, either monoclonal or polyclonal, having specificity for GLP-2, can assist in mediating any such problem. The antibody may be generated or derived from a host immunized with the particular GLP-2 derivative, or with an immunogenic fragment of the agent, or a synthesized immunogen corresponding to an antigenic determinant of the agent. Preferred antibodies will have high specificity and affinity for native, derivatized and conjugated forms of the GLP-2 peptide derivative. Such antibodies can also be labeled with enzymes, fluorochromes, or radiolabels.
Antibodies specific for the GLP-2 derivatives may be produced by using purified GLP-2 peptides for the induction of derivatized GLP-2-specific antibodies. By induction of antibodies, it is intended not only the stimulation of an immune response by injection into animals, but analogous steps in the production of synthetic antibodies or other specific binding molecules such as screening of recombinant immunoglobulin libraries. Both monoclonal and polyclonal antibodies can be produced by procedures well known in the art.
The antibodies may also be used to monitor the presence of the GLP-2 peptide in the blood stream. Blood and/or serum samples may be analyzed by SDS-PAGE and western blotting. Such techniques permit the analysis of the blood or serum to determine the bonding of the GLP-2 derivative to blood components.
The anti-therapeutic agent antibodies may also be used to treat toxicity induced by administration of the GLP-2 derivative, and may be used ex vivo or in vivo. Ex vivo methods would include immuno-dialysis treatment for toxicity employing anti-therapeutic agent antibodies fixed to solid supports. In vivo methods include administration of anti-therapeutic agent antibodies in amounts effective to induce clearance of antibody-agent complexes.
The antibodies may be used to remove the GLP-2 derivatives and conjugates thereof, from a patient's blood ex vivo by contacting the blood with the antibodies under sterile conditions. For example, the antibodies can be fixed or otherwise immobilized on a column matrix and the patient's blood can be removed from the patient and passed over the matrix. The GLP-2 derivatives will bind to the antibodies and the blood containing a low concentration of GLP-2, then may be returned to the patient's circulatory system. The amount of GLP-2 derivative removed can be controlled by adjusting the pressure and flow rate. Preferential removal of the GLP-2 derivative from the serum component of a patient's blood can be effected, for example, by the use of a semipermeable membrane, or by otherwise first separating the serum component from the cellular component by ways known in the art prior to passing the serum component over a matrix containing the anti-therapeutic antibodies. Alternatively the preferential removal of GLP-2-conjugated blood cells, including red blood cells, can be effected by collecting and concentrating the blood cells in the patient's blood and contacting those cells with fixed anti-GLP-2 antibodies to the exclusion of the serum component of the patient's blood.
The anti-GLP-2 antibodies can be administered in vivo, parenterally, to a patient that has received the GLP-2 derivative or conjugates for treatment. The antibodies will bind the GLP-2 derivative and conjugates. Once bound, the GLP-2 activity will be hindered if not completely blocked thereby reducing the biologically effective concentration of GLP-2 derivative in the patient's bloodstream and minimizing harmful side effects. In addition, the bound antibody-GLP-2 complex will facilitate clearance of the GLP-2 derivative and conjugates from the patient's blood stream.
The following examples are provided to illustrate preferred embodiments of the invention and shall by no means be construed as limiting its scope. Unless indicated otherwise, optically active protected amino acids in the L-configuration were used.
Synthesis
The synthesis of the GLP-2 peptides and derivatives thereof was performed using an automated solid-phase procedure on a Symphony™ peptide synthesizer with manual intervention during the generation of the GLP-2 derivatives. The synthesis was performed on Fmoc-protected Ramage™ amide linker resin using Fmoc-protected amino acids. Coupling was achieved by using O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) as activator in N,N-dimethylformamide (DMF) solution and diisopropylethylamine (DIEA) as base. The Fmoc protective group was removed using 20% piperidine/DMF. When needed, a Boc-protected amino acid was used at the N-terminus in order to generate the free Nα-terminus after the peptide was cleaved from the resin. All amino acids used during the synthesis possessed the L-stereochemistry unless otherwise stated. Glass reaction vessels were Sigmacoted™ and used during the synthesis.
Example 1 (not of the claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe--Ser-Asp-Glu-Met-Asn- Thr-De- Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OR, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Boc)-OH. They were dissolved in N,N-dimethylformamide (DMF) and, according to the sequence, activated using O-benzotriazol-1-yl-N, N, N', N-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and diisopropylethylamine (DIEA). Removal of the Fmoc protecting group was achieved using a solution of 20% (V/V) piperidine in N,N-dimethylformamide (DMF) for 20 minutes.
Step 2: The peptide was cleaved from the resin using 85% TFA/5% TIS/5% thioanisole and 5% phenol, followed by precipitation by dry-ice cold (0-4°C) Et2O. The crude peptide was collected on a polypropylene sintered funnel, dried, redissolved in a 40% mixture of acetonitrile in water (0-1% TFA) and lyophilized to generate the corresponding crude material used in the purification process.
Example 2 (not of the claimed invention)
MPA-His-Ala-Asp-Gly-Set-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Pbe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Emoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmov-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, MPA-OH.
Step 2: This step was performed in the same manner as step 2 of Example 1.
Example 3 (not of the claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manner as step 1 of Example 1 above, except that the first amino acid added to the resin was Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Step 2: The selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and accomplished by treating the resin with a solution of 3 eq of Pd(PPh3)4 dissolved in 5 mL of C6H6 :CHCl3 (1:1) : 2.5% NMM (v:v): 5% AcOH (v:v) for 2 h. The resin is then washed with CHCl3 (6 x 5 mL), 20% AcOH in DCM (6 x 5 mL), DCM (6 x 5 mL), and DMF (6 x 5 mL).
Step 3: The synthesis was then re-automated for the addition of the 3-maleimidopropionic acid. Between every coupling, the resin was washed 3 times with N,N dimethylformamide (DMF) and 3 times with isopropanol.
Step 4: The peptide was cleaved from the resin using 85% TFA/5% TIS/5% thioanisols and 5% phenol, followed by precipitation by dry-ice cold (0-4°C) Et2O. The crude peptide was collected on a polypropylene sintered funnel, dried, redissolved in a 40% mixture of acetonitrile in water (0.1% TFA) and lyophilized to generate the corresponding crude material used in the purification process.
Example 4 (not of the claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin following the procedure described in step 1 of Example 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Boc-His(Boc)-OH.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 3.
Example 5 (not of the claimed invention)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Sez-Phe-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin following the procedure described in step 1 of Example 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-His(Boc)-OH.
Step 2: This step was performed in the same manner as step 2 of Example 1.
Example 6 (not of the claimed univention)
MPA-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manner as step 1 as in Example 2 except that the alanine residue in position 2 has been replaced with a glycine.
Step 2: This step was performed in the same manner as step 2 of Example 1.
Example 7 (not of the claimed invention)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-De-Gln-Thr-Lys-ne- Tbr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin following the procedure described in step 1 of Example 1: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Pmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(AlocrOH, Fuaoc-Asp(tBu)-OK Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(TTt)-OH Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Sef(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoe-Gly-OK Boc-His(Boc)-OH.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 3.
Example 8
His-Gly-Asp-Gly-Ser- Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn- Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manrmer as step 1 of Example 5 above, except that the first amino acid added to the resin was Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 3.
Example 9 (not of the claimed invention)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(AEEA-MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manner as step 1 of Example 7.
Step 2: The selective deprotection of the Lys (Aloc) group was performed manually and accomplished by treating the resin with a solution of 3 eq of Pd(PPh3)4 dissolved in 5 mL of C6H6 :CHCl3 (1:1) : 2.5% NMM (v:v): 5% AcOH (v:v) for 2 h. The resin is then washed with CHCl3 (6 x 5 mL), 20% AcOH in DCM (6 x 5 mL), DCM (6 x 5 mL), and DMF (6 x 5 mL).
Step 3: The synthesis was then re-automated for the addition of the Fmoc-AEEA-0H (Fmoc-aminoethoxyethoxy acetic acid). Between every coupling, the resin was washed 3 times with N.N-dimethylformamide (DMF) and 3 times with isopropanol After proper deprotection, the MPA (3-maleimidopropionic acid) was anchored to the spacer and again the resin was washed 3 times with N,N-dimethylformamide (DMF) and 3 times with isopropanol.
Step 4: The peptide was cleaved from the resin using 85% TFA/5% TIS/5% thioanisole and 5% phenol, followed by precipitation by dry-ice cold (0-4°C) Et2O. The crude peptide was collected on a polypropylene sintered funnel, dried, redissolved in a 40% mixture of acetonitrile in water (0.1% TFA) and lyophilized to generate the corresponding crude material used in the purification process.
Example 10
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asu-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH2
Step 1: This step was performed in the same mannner as step 1 of Example 5 above, except that the first amino acid added to the resin was Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 9.
Example 11 (not of the claimed invention)
MPA-AEEA-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Tht-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manner as step I of Example 6 except that Fmoc-AEEA-OH is added to the resin prior to MPA-OH at the end of the synthesis.
Step 2: This step was performed in the same manner as step 2 of Example 1.
Example 12 (not of the claimed invention)
MPA-AEEA-His-Ala-Asp-Cly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: This step was performed in the same manner as step 1 of Example 1 except that Fmoc-AEEA-OH is added to the resin prior to MPA-OH at the end of the synthesis.
Step 2: This step was performed in the same manner as step 2 of Example 1.
Example 13 (not of the claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH2
Step 1: This step was performed in the same mannner as step 1 of Example 1 above, except that the first amino acid added to the resin was Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 9.
Example 14 (not of the claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(AEEA-MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: This step was performed in the same mannner as step 1 of Example 4.
Steps 2-4: These steps were performed in the same manner as steps 2-4 of Example 9.
Example 15 (not of claimed invention)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Lys(MPA)-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Step 1: Solid phase peptide synthesis was carried out on a 100 µmole scale. The following protected amino acids were sequentially added to resin following the procedure described in step 1 of Example 1 : Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, F
Traduzione - Italiano Titolo: PEPTIDE GLUCAGONE-SIMILE 2 (GLP-2) DI LUNGA DURATA PER IL TRATTAMENTO DI MALATTIE E DISORDINI GASTROINTESTINALI
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Descrizione
CAMPO DELL'INVENZIONE
Questa invenzione riguarda derivati del peptide glucagone-simile 2 (GLP-2). In particolare, questa invenzione riguarda derivati peptidici di GLP-2 aventi un'emivita in vivo prolungata, per il trattamento o la prevenzione di disordini o malattie gastrointestinali, come la malattia infiammatoria delle viscere e altre funzioni gastrointestinali, per qualsiasi segmento del tratto gastrointestinale, dall'esofago all'ano.
SFONDO DELL'INVENZIONE
GLP-2 è un peptide di 33 amminoacidi espresso in modo tessuto-specifico dal gene pleiotropico proglucagone, e quindi appartenente alla super-famiglia di ormoni peptidici del glucagone. Un'elaborazione post-traduzionale alternativa del proglucagone avviene in pancreas, intestino e cervello. Tagli enzimatici del proglucagone producono numerosi ormoni peptidici multifunzionali coinvolti nel metabolismo dei nutrienti. I principali ormoni bioattivi derivati dal proglucagone sono nelle cellule α pancreatiche, mentre GLP-1 e GLP-2 si trovano nelle cellule L intestinali e nel cervello. I primi a scoprire che il proglucagone possiede potenti proprietà intestinotropiche sono stati Drucker et al. (vedere Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. 93, (115), 7911-7916). È stato dimostrato che GLP-2, in quando peptide naturale di derivazione intestinale, ha una significativa attività riparativa per l'epitelio mucoso dell'intestino tenue e crasso. È stato inoltre dimostrato che tale peptide aumenta la capacità dell'intestino di digerire e assorbire nutrienti, suggerendo un potenziale ruolo terapeutico nel trattamento di un'insufficienza intestinale. Infatti, numerosi studi hanno ora confermato che la somministrazione di GLP-2 riduce o previene una lesione intestinale in modelli di colite, enterite, nutrizione parenterale totale e resezione massiva in roditori. In tempi molto recenti sono state anche riportate prove cliniche di fase 2 su GLP-2, in cui è stato dimostrato che pazienti affetti da sindrome dell'intestino corto evidenziano una capacità aumentata di assorbire nutrienti enterali dopo 30 giorni di somministrazione di GLP-2, apparentemente senza effetti collaterali indesiderabili.
La principale via metabolica di smaltimento per GLP-2 passa attraverso una degradazione enzimatica. È stato mostrato che GLP-2 viene rapidamente degradato attraverso la rimozione dei suoi due amminoacidi N-terminali da parte della dipeptidilpeptidasi-IV (DPP-IV), cosa che rappresenta un grande limite in quanto porta alla completa inattivazione del peptide. Di conseguenza, l'emivita di GLP-2 risulta quindi essere piuttosto corta, e l'attuale trattamento con GLP-2 richiede un'infusione o iniezioni frequenti. È stato inoltre mostrato che lo smaltimento (clearance) renale è coinvolto nello smaltimento di GLP-2. L'azione principale di GLP-2 implica una stimolazione della crescita cellulare, e il meccanismo che associa l'attivazione del recettore di GLP-2, in modo diretto o indiretto, alla proliferazione cellulare, non è stato esaminato.
È stato mostrato che analoghi peptidici del GLP-2 nativo possiedono un'aumentata attività trofica nell'intestino tenue come antagonisti del recettore di GLP-2 (vedere ad esempio US 5.990.077).
Nonostante la loro notevole utilità, uno svantaggio critico dei peptidi e analoghi di GLP-2, come detto sopra, è rappresentato dalle loro brevi emivite in vivo, che sono tipicamente non superiori a 2 minuti.
La malattia infiammatoria delle viscere (IBD, inflammatory bowel disease) è un gruppo di disordini cronici che provocano l'infiammazione e l'ulcerazione dell'intestino tenue e crasso. Questa malattia può anche costituire una minaccia mortale e, allo stato attuale, non esistono cure note. La IBD indica comunemente la colite ulcerosa (UC), limitata al colon, e il morbo di Crohn (CD, Crohn's disease), che può interessare l'intero tratto gastrointestinale, dando vita ad un ciclo cronico di remissioni e recrudescenze. Sono numerosi i prodotti farmaceutici noti per il trattamento di IBD, ad esempio per sopprimere l'infiammazione, prevenire le recrudescenze, controllare sintomi come dolore o diarrea, oppure sostituire o integrare nutrienti essenziali che vengono scarsamente assorbiti a causa di una malattia estesa o di un intervento chirurgico. Le attuali opzioni di trattamento comprendono un'ampia varietà di prodotti farmaceutici come amminosalicilati, corticosteroidi, immunomodulatori e agenti anti-TNF-α, e sono concepite per ridurre l'infiammazione e alleviare i sintomi, oltre che per sostituire i fluidi e nutrienti persi. La maggior parte di questi prodotti, tuttavia, ha un uso limitato in IBD, a causa dei loro effetti collaterali indesiderabili sul corpo in generale.
Ogni anno, negli Stati Uniti e in Europa, circa un milione di persone viene trattata per IBD, la maggior parte della quali è affetta da morbo di Crohn o colite ulcerosa. Di fatto, per i soggetti affetti da IBD, non è insolito il fatto di doversi sottoporre ad un intervento chirurgico radicale che comporta la rimozione di parti importanti dell'intestino. I costi sanitari annuali diretti per IBD ammontano a circa 700 milioni di dollari statunitensi, e l'impatto economico totale dei costi, siano essi diretti o indiretti, si avvicina ai 2-3 miliardi di dollari all'anno in tutto il mondo. I trattamenti esistenti, pur fornendo spesso sollievo, hanno alcuni inconvenienti.
US 5.789.379 insegna analoghi di GLP-2, uno dei quali è stato sviluppato come composto di lunga durata (ALX-600™) e si trova attualmente in prove cliniche. Tuttavia, benché la degradazione di GLP-2 per opera di DPP-IV sembri in qualche modo impedita, la sua emivita rimane limitata dalla clearance renale e non supera i 2 minuti, come detto sopra.
È stato sviluppato un anticorpo chimerico (Remicade™) che si lega specificatamente al fattore di necrosi tumorale alfa umano (TNF-α), per il trattamento a breve termine del morbo di Crohn. Questo anticorpo è indicato per la riduzione dei sintomi del morbo di Crohn moderato-severo, in pazienti che hanno evidenziato una risposta inadeguata alla terapia convenzionale con corticosteroidi, altri immunosoppressivi e/o antibiotici. Tuttavia, con tale trattamento, vengono osservati seri effetti collaterali. È stato ad esempio associato a reazioni di ipersensibilità, infezioni serie, sepsi inclusa, oltre che ad infezioni mortali. La sua somministrazione potrebbe inoltre predisporre i pazienti ad infezioni attraverso il blocco di TNF.
Con la prevalenza di IBD in aumento negli ultimi anni, sarebbe dunque altamente desiderabile sviluppare derivati o analoghi del peptide GLP-2 in grado di mantenere sostanzialmente lo stesso livello di attività, la stessa bassa tossicità e gli stessi vantaggi terapeutici di GLP-2, ma con un'emivita in vivo più lunga, evitando così la necessità di una sua continua somministrazione, nel trattamento di varie malattie come malattia infiammatoria delle viscere, morbo di Crohn e colite ulcerosa, che rappresentano la due malattie infiammatorie principali delle viscere.
WO 00/69900 descrive la protezione di peptidi terapeutici endogeni dall'attività di peptidasi attraverso la coniugazione con componenti ematici.
RIEPILOGO DELL'INVENZIONE
Secondo la presente invenzione, è ora fornito un derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, avente un'emivita in vivo prolungata rispetto al corrispondente promotore di crescita gastrointestinale GLP-2 non modificato. La presente invenzione fornisce un derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, selezionato dal gruppo costituito da:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2; e His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH2
dove MPA è acido maleimmidopropionico ed AEEA è acido 2-[2-(2-ammino)etossi] etossi acetico. Il derivato di GLP-2 comprende un'entità reattiva (MPA) ad esso accoppiata e in grado di reagire con funzionalità disponibili su un componente ematico, sia in vivo che ex vivo, formando un legame covalente stabile. Il legame covalente formato tra il derivato di GLP-2 e il componente ematico impedisce il taglio indesiderabile di GLP-2 da parte di enzimi come la dipeptidilpeptidasi IV, prolungando così la sua emivita e la sua attività in vivo.
Componenti ematici preferiti comprendono proteine come immunoglobuline, tra cui IgG e IgM, albumina di siero, ferritina, proteine leganti gli steroidi, transferrina, proteina legante la tiroxina, α-2-macroglobulina, aptoglobina, ecc., essendo maggiormente preferite albumina di siero e IgG, ed essendo preferita in assoluto l'albumina di siero.
L'entità reattiva, l'acido maleimmidopropionico (MPA), è in grado di formare un legame covalente con il componente ematico, reagendo con i gruppi tiolo presenti su tale componente, sia in vivo che in vitro (o ex vivo).
In un altro aspetto dell'invenzione, è fornita una composizione farmaceutica comprendente il presente derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, in combinazione con un trasportatore farmaceuticamente accettabile. Tale composizione è utile nel trattamento o nella prevenzione di disordini e malattie delle viscere, come la malattia infiammatoria delle viscere e altre funzioni gastrointestinali. La composizione può anche essere usata in terapia genica per indurre cellule alla produzione endogena del derivato peptidico del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, le quali cellule possono quindi essere impiantate in un soggetto allo scopo di produrre l'effetto biologico desiderato. Infine, la composizione può anche essere usata nella produzione di composizioni farmaceutiche o veterinarie per incrementare la crescita di tessuto dell'intestino crasso.
In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, è fornito il presente derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, o un suo coniugato, per l'uso nel trattamento o nella prevenzione di disordini o malattie delle viscere come la malattia infiammatoria delle viscere, e di funzioni gastrointestinali in un soggetto, preferibilmente un mammifero, animale o essere umano.
In un ulteriore aspetto della presente invenzione, è fornito un coniugato comprendente il presente derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, legato in modo covalente ad un componente ematico.
È descritto un metodo per prolungare l'emivita in vivo di un promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 in un soggetto, il metodo comprendendo il passaggio di legare, in modo covalente, il derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 ad un componente ematico. Il legame covalente può avvenire in vivo o in vitro.
I composti promotori di crescita del tessuto gastrointestinale sono peptidi che sono analoghi di GLP-2, che possiedono un'attività di promozione della crescita del tessuto gastrointestinale. Più avanti sono illustrati dettagli delle sequenze di questi analoghi.
Un ulteriore uso del presente composto derivato può essere la determinazione dell'attività intestinotrofica di un ormone quando usato in combinazione con il presente composto derivato e, in particolare, quando il composto è un analogo di GLP-2 o un frammento di GLP-2. Tale metodo comprende i passaggi di: (a) co-somministrare l'ormone con una quantità intestinotrofica del derivato di GLP-2 ad un soggetto di prova; (2) valutare la conseguente crescita di tessuto dell'intestino tenue e crasso nel soggetto di prova; e (3) determinare se la crescita di tessuto dell'intestino tenue e/o crasso nel soggetto di prova è incrementata rispetto a soggetti di controllo trattati con un analogo di GLP-2 non modificato o con un derivato di GLP-2 non modificato.
Se è presente un gruppo di legame, esso è acido 2-[2-(2-ammino)etossi]etossi acetico, AEEA.
NEI DISEGNI
La Figura 1 illustra le variazioni di peso umido dell'intestino tenue in topi trattati con soluzione salina o 5 µg dei composti degli esempi 1-8, due volte al giorno per 10 giorni (n = 10/gruppo). I risultati sono espressi come media della variazione di peso (delta) rispetto al controllo ± ESM.
La Figura 2 illustra variazioni di peso umido dell'intestino tenue e dell'intestino crasso in topi trattati con soluzione salina o 5, 25 o 50 µg dei composti degli esempi 5, 7 e 8, due volte al giorno per 10 giorni (n = 10/gruppo). I risultati sono espressi come peso medio ± ESM.
La Figura 3 illustra le concentrazioni medie nel plasma per i composti degli esempi 5 e 8 in ratti Sprague-Dawley dopo una singola dose intravenosa o sottocutanea di 500 nmol/kg (n = 4/gruppo).
La Figura 4 illustra il rilevamento del composto dell'esempio 8 coniugato a proteine plasmatiche di ratto utilizzando un anticorpo policlonale, anticorpo anti-GLP-2, e il confronto con il modello ottenuto con un anticorpo anti-albumina di ratto.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La bioconiugazione in vivo è il processo di legare in modo covalente una molecola, come il presente composto derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, all'interno del corpo, a componenti ematici bersaglio, preferibilmente proteine, in maniera tale da permettere un sostanziale mantenimento, o in alcuni casi un incremento, dell'attività biologica del peptide promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 originale non modificato, fornendo allo stesso tempo una durata prolungata dell'attività biologica attraverso il conferimento dei parametri biofisici del componente ematico bersaglio al derivato di GLP-2.
Per gli scopi della presente invenzione, i termini "analogo" o "frammento" intendono comprendere sequenze di amminoacidi, peptidi inclusi, con sequenze di amminoacidi differenti rispetto alla sequenza nativa, come la sequenza di GLP-2, ma con un'attività simile o paragonabile. Tali analoghi hanno preferibilmente una sequenza di amminoacidi almeno 60%, e più preferibilmente almeno 80%, e con preferenza assoluta almeno 95% uguale a quella di GLP-2 o di un frammento di GLP-2 avente lo stesso numero di residui di amminoacido.
Il presente derivato di peptide promotore di crescita del tessuto gastrointestinale comprende un peptide promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, che è stato modificato accoppiandolo con un'entità reattiva, in modo diretto o attraverso un gruppo di legame, l'entità reattiva essendo in grado di formare un legame covalente con un componente ematico, preferibilmente con proteine ematiche. L'entità reattiva è stabile in ambiente acquoso, ed è MPA. Il legame covalente viene formato tra l'entità reattiva e un gruppo tiolo sul componente ematico. Il componente ematico preferito comprende componenti mobili del sangue come albumina di siero, immunoglobuline o loro combinazioni. In una forma di realizzazione preferita in assoluto, il componente ematico è albumina di siero.
I componenti ematici sono preferibilmente mobili, il che significa che non hanno un sito fisso per qualsiasi periodo prolungato di tempo, in genere non maggiore di 5 minuti, e più normalmente di 1 minuto. Questi componenti ematici non sono associati alla membrana, e sono presenti nel sangue per periodi prolungati di tempo in una concentrazione minima di almeno 0,1 µg/mL. Componenti ematici mobili preferiti comprendono albumina di siero, transferrina, ferritina e immunoglobuline come IgM e IgG. L'emivita dei componenti ematici mobili è almeno 12 ore circa.
Il presente derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale è un peptide GLP-2, ragione per cui, durante il processo di sintesi del derivato di GLP-2, possono rendersi necessari dei gruppi protettivi. Questi gruppi protettivi sono convenzionali nel ramo della sintesi peptidica, e possono essere genericamente descritti come porzioni chimiche capaci di proteggere il derivato peptidico dalla reazione con altri gruppi funzionali. In commercio sono disponibili diversi gruppi protettivi, e loro esempi possono essere trovati in US 5.493.007, qui incorporato per rimando. Esempi tipici di gruppi protettivi adatti comprendono acetile, fluorenilmetilossicarbonile (FMOC), t-butilossicarbonile (BOC), benzilossicarbonile (CBZ), ecc. La Tabella 1 fornisce le abbreviazioni a tre lettere e monolettera per gli amminoacidi.
TABELLA 1
AMMINOACIDI NATURALI E LORO ABBREVIAZIONI
Nome Abbreviazione a 3 lettere Abbreviazione a 1 lettera
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Acido aspartico Asp D
Cisteina Cys C
Acido glutammico Glu E
Glutammina Gln Q
Glicina Gly G
Istidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe - F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptofano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V
Dopo la coniugazione con un componente ematico, un'albumina, il derivato di GLP-2 forma un peptide stabilizzato alle peptidasi. È anche contemplato che, prima dell'aggiunta dell'entità reattiva, uno o più amminoacidi supplementari possano essere aggiunti o sostituiti nel peptide, così da facilitare l'accoppiamento dell'entità reattiva al peptide. Tale aggiunta o sostituzione può essere condotta sull'N-terminale, sul C-terminale, o tra le due estremità. Il derivato peptidico così ottenuto può essere somministrato ad un soggetto, animale o umano, in modo tale che la coniugazione con i componenti ematici avvenga in vivo, o può essere prima coniugato a componenti ematici del soggetto, animale o umano, in vitro, e il risultante coniugato o peptide stabilizzato alle peptidasi, come definito sotto, può essere somministrato al soggetto.
Qualsiasi amminoacido presente, sostituito o aggiunto alla sequenza di GLP-2, può essere un D-amminoacido o un L-amminoacido, o una loro combinazione. Sono generalmente preferiti gli L-amminoacidi. I derivati della presente invenzione hanno una sostituzione di glicina nella posizione 2 della sequenza nativa di GLP-2, in quanto conferisce all'analogo una maggiore resistenza all'enzima DPP-IV.
Un derivato di GLP-2 stabilizzato alle peptidasi è più stabile in presenza di peptidasi in vivo, rispetto al corrispondente analogo di GLP-2 non stabilizzato. La stabilità alle peptidasi viene determinata confrontando l'emivita dell'analogo di GLP-2 nativo in siero o sangue, con l'emivita del corrispondente derivato contenente l'entità reattiva in siero o sangue. L'emivita viene determinata campionando il siero o il sangue in seguito alla somministrazione del derivato o del peptide non modificato, e determinando l'attività di ciascun composto.
In maggiore dettaglio, la presente invenzione è diretta alla modifica di GLP-2, e di suoi analoghi e frammenti, per migliorare la sua biodisponibilità, prolungare la sua emivita in vivo, e migliorare la sua distribuzione attraverso la coniugazione selettiva su un componente ematico, pur mantenendo sostanzialmente o migliorando le loro notevoli proprietà terapeutiche.
È noto che il GLP-2 umano ha la seguente sequenza:
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Tbr-Lys-Ile-Thr-Asp.
L'invenzione riguarda utilizzi terapeutici e correlati di derivati di GLP-2 aventi un'emivita in vivo prolungata, in particolare per
- promuovere la crescita di tessuto dell'intestino tenue e/o crasso;
- aumentare i livelli nel sangue di un derivato di GLP-2;
- ripristinare o mantenere la funzione gastrointestinale;
- promuovere la guarigione o la ricrescita di una mucosa intestinale danneggiata o ulcerata/infiammata;
- ridurre il rischio di una malattia enterica;
- potenziare lo stato nutrizionale;
- trattare o prevenire disordini o malattie nutrizionali o gastrointestinali;
- ridurre la perdita di peso;
- ridurre l'espressione dell'interleuchina-1;
- aumentare la lunghezza del colon, sia l'area mucosa che l'integrità del colon, e la profondità delle cripte;
- promuovere la crescita dei villi in soggetti affetti da una malattia come celiachia, atrofia post-infettiva dei villi, e sindromi da intestino corto;
- promuovere la proliferazione dell'intestino tenue e crasso in un soggetto sano, ad esempio per consentire una maggiore assimilazione di nutrienti nel bestiame, così da permettere uno svezzamento precoce o una produzione aumentata di latte e carne; ecc.
L'effetto sulla crescita sollecitato dai presenti derivati di GLP-2 manifesta un aumento di peso dell'intestino tenue rispetto ad un controllo sottoposto a trattamento fittizio. In particolare, si ritiene che i presenti derivati di GLP-2 abbiano un'attività "intestinotrofica" se, quando valutati nel modello murino qui esemplificato, l'analogo media un aumento di peso dell'intestino tenue di almeno 10%, rispetto ad un animale di controllo che riceve il veicolo da solo. Particolarmente adatti per l'uso terapeutico sono quei derivati che mediano un aumento di peso dell'intestino tenue di almeno 20%, mentre quelli maggiormente preferiti mediano un aumento di peso dell'intestino tenue uguale o maggiore di 50%. Con assoluta significatività, l'attività intestinotrofica viene notata in relazione al digiuno, comprendente il digiuno distale e, in particolare, il digiuno prossimale, e viene anche notata nell'ileo.
Oltre a evidenziare un'attività intestinotrofica, i presenti derivati di GLP-2 incorporano una sostituzione di amminoacido all'interno di una "struttura portante" del peptide GLP-2, che è una variante di una specie di GLP-2 di mammifero in cui il C-terminale è stato alterato attraverso l'aggiunta di un residuo basico. I presenti derivati peptidici incorporano dunque un residuo di lisina aggiunto al C-terminale della sequenza del peptide GLP-2.
La funzionalità presente sulla proteina sarà un gruppo tiolo, mentre l'entità reattiva sarà il gruppo contenente maleimmido, acido maleimmidopropionico (MPA) o acido 2-[2-(2-ammino)etossi)]etossi acetico (AEEA)-MPA.
I gruppi maleimmide sono i più selettivi per i gruppi solfidrile sui peptidi, quando il pH della miscela di reazione è mantenuto tra 6,5 e 7,4. A pH 7,0, la velocità di reazione dei gruppi maleimmido con i solfidrili è 1000 volte più rapida rispetto a quella con le ammine. Tra il gruppo maleimmido e il solfidrile viene formato un legame tioetere stabile che non può essere tagliato sotto condizioni fisiologiche.
I derivati di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale dell'invenzione forniscono una marcatura specifica di componenti ematici. Tale marcatura specifica, in particolare con una maleimmide, offre numerosi vantaggi. I gruppi tiolo liberi sono meno abbondanti in vivo rispetto ai gruppi ammino e, di conseguenza, i derivati di maleimmide si legano in modo covalente ad un numero minore di proteine. Ad esempio, nell'albumina di siero è presente un solo gruppo tiolo libero per molecola. Un coniugato GLP-2-maleimmide-albumina tenderà a comprendere un rapporto molare di 1:1 tra peptide e albumina. Oltre all'albumina, anche le molecole IgG (classe II) hanno tioli liberi. Poiché le molecole di IgG e l'albumina di siero costituiscono la maggior parte delle molecole solubili nel sangue, ovvero il 99%, esse costituiscono anche la maggior parte dei gruppi tiolo liberi disponibili per un legame covalente ad un GLP-2 sostituito con maleimmide.
Inoltre, anche tra le proteine ematiche contenenti tiolo libero, la marcatura specifica con una maleimmide porta alla formazione preferenziale di coniugati peptidici maleimmide-albumina, in considerazione delle caratteristiche precipue dell'albumina stessa. Il singolo gruppo tiolo libero dell'albumina, altamente conservato tra le specie, è localizzato sul residuo di amminoacido Cys34. È stato recentemente dimostrato che la Cys34 dell'albumina ha una maggiore reattività rispetto ai tioli liberi presenti su altre proteine contenenti tiolo libero. Questo è in parte dovuto al valore insolito di pK, 5,5, della Cys34 di albumina. Questo valore è decisamente più basso rispetto ai tipici valori di pK dei residui di cisteina in generale, che sono tipicamente pari a 8 circa. Grazie a questo basso pK, sotto normali condizioni fisiologiche, la Cys34 dell'albumina si trova prevalentemente nella forma anionica, e ciò aumenta drasticamente la sua reattività. Oltre al basso valore di pK della Cys34, un altro fattore che incrementa la reattività della Cys34 è la sua posizione, trovandosi in una tasca idrofoba prossima alla superficie di una singola ansa di regione V dell'albumina. Questa posizione rende la Cys34 accessibile a ligandi di tutti i generi, e rappresenta un fattore importante nel ruolo biologico della Cys34 come trappola di radicali liberi e neutralizzatore di tioli liberi. Di conseguenza, l'accelerazione della velocità di reazione può arrivare ad essere 1000 volte maggiore rispetto alle velocità di reazione di maleimmidi peptidiche con altre proteine contenenti tiolo libero.
Un altro vantaggio dei coniugati peptide-maleimmide-albumina è la riproducibilità associata al caricamento 1:1 tra peptide e albumina che avviene in modo specifico sulla Cys34. Le convenzionali tecniche di attivazione, come con glutaraldeide, DCC, EDC e altri attivatori chimici di, ad esempio, ammine libere, mancano di questa selettività. Ad esempio, l'albumina contiene 52 residui di lisina, 25-30 dei quali sono localizzati sulla superficie dell'albumina e sono accessibili per la coniugazione. L'attivazione di questi residui di lisina, o, in alternativa, la modifica di un peptide per l'accoppiamento attraverso questi residui di lisina, genera una popolazione eterogenea di coniugati. Anche utilizzando un rapporto equimolare peptide:albumina (ovvero 1:1), il risultato finale è la formazione di prodotti di coniugazione causali, alcuni contenenti un numero indefinito di peptidi legati a ciascuna molecola di albumina, e ciascun coniugato avendo peptidi accoppiati in modo causale su qualsiasi dei 25-30 siti di lisina disponibili. Di conseguenza, è praticamente impossibile ottenere una caratterizzazione dell'esatta composizione, per non parlare dell'assenza di riproducibilità. Inoltre, nonostante sembri che la coniugazione attraverso residui di lisina di albumina possa almeno avere il vantaggio di distribuire una quantità maggiore di agente terapeutico per molecola di albumina, studi hanno mostrato che è preferibile un rapporto 1:1 tra l'agente terapeutico e l'albumina. In un articolo di Stehle, et al. in Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685, è stato riportato che un rapporto 1:1 tra l'antitumorale metotrexato e l'albumina, coniugati attraverso glutaraldeide, ha dato i risultati più promettenti. Questi coniugati sono stati assorbiti dalle cellule tumorali, mentre coniugati contenenti molecole di metotrexato in un rapporto da 5:1 a 20:1 avevano profili HPLC alterati, e venivano rapidamente assorbiti dal fegato in vivo. Sembrerebbe quindi che, con rapporti maggiori, l'efficacia dell'albumina come trasportatore per un agente terapeutico venga ridotta.
Attraverso la somministrazione controllata del presente derivato peptidico di GLP-2, e in particolare di un peptide GLP-2 comprendente un'entità reattiva di maleimmide, è possibile controllare la marcatura specifica o il legame specifico in vivo di albumina e IgG. In somministrazioni tipiche, è stato mostrato che l'80-90% del derivato peptidico somministrato si lega all'albumina, mentre meno del 5% si lega a IgG. Avviene anche un legame in traccia dei tioli liberi presenti, come glutatione. Tale legame specifico è preferibile per un uso in vivo, in quanto permette un calcolo preciso dell'emivita stimata dell'agente terapeutico somministrato.
In generale, i peptidi GLP-2 sostituiti con maleimmide sono abbastanza stabili in presenza di soluzioni acquose e in presenza di ammine libere. Dato che i peptidi GLP-2 sostituiti con maleimmide reagiscono con i tioli liberi, non sono necessari gruppi protettivi per impedire una reazione incrociata tra loro.
Come affermato sopra, i coniugati desiderati tra derivati di GLP-2 e componenti ematici possono essere preparati in vivo, mediante somministrazione diretta dei derivati al soggetto, che può essere un animale o una persona. La somministrazione può essere effettuata sotto forma di un bolo, o può essere introdotta lentamente nel tempo per infusione, usando un flusso dosato o similare.
In alternativa, il coniugato può anche essere preparato ex vivo, combinando sangue o componenti ematici purificati disponibili in commercio con il presente derivato di GLP-2, permettendo al derivato di GLP-2 di legarsi in modo covalente alle funzionalità sui componenti ematici, e quindi restituendo o somministrando il sangue coniugato, o il componente ematico purificato coniugato, all'ospite. Inoltre, quanto sopra può anche essere condotto prima purificando un singolo componente ematico o un numero limitato di componenti, come eritrociti, immunoglobuline, albumina di siero o similare, e quindi combinando il componente o i componenti ex vivo con il presente composto derivato. Il sangue o componente ematico marcato possono quindi essere restituito al soggetto, così da fornire in vivo i coniugati terapeuticamente efficaci. Il sangue può anche essere trattato in modo da impedire una sua coagulazione durante la manipolazione ex vivo.
Sintesi peptidica
I peptidi GLP-2 possono essere sintetizzati attraverso metodi standard di chimica dei peptidi in fase solida, ampiamente noti a qualsiasi persona avente una conoscenza ordinaria del ramo. Il peptide può ad esempio essere sintetizzato, attraverso tecniche di chimica in fase solida, osservando le procedure descritte in Steward et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984), adoperando un sintetizzatore Rainin PTI Symphony™. In modo simile, è possibile sintetizzare frammenti peptidici, e quindi combinarli o legarli insieme per formare un peptide più grande (condensazione di segmenti). Questi frammenti peptidici sintetici possono anche essere realizzati con sostituzioni e/o delezioni di amminoacido in specifiche posizioni.
Per la sintesi di peptidi in fase solida, un riepilogo delle numerose tecniche può essere trovato in Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963, e in Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 1973, 2, 46. Per la classica sintesi in soluzione, vedere ad esempio Schroder et al. in "The Peptides", volume 1, Acacemic Press (New York). In generale, tale metodo comprende l'aggiunta sequenziale di uno o più amminoacidi, o di amminoacidi opportunamente protetti, ad una catena peptidica in crescita su un polimero. Il gruppo ammino o carbossile del primo amminoacido viene normalmente protetto con un adatto gruppo protettivo. L'amminoacido protetto e/o funzionalizzato viene quindi o fissato ad un supporto solido inerte, o utilizzato in soluzione, aggiungendo l'amminoacido successivo nella sequenza, avente il gruppo complementare (ammino o carbossile) opportunamente protetto, e sotto condizioni adatte alla formazione di un legame ammidico. Da questo residuo di amminoacido appena aggiunto viene poi rimosso il gruppo protettivo, viene aggiunto l'amminoacido successivo (opportunamente protetto), e così via.
Una volta legati tutti gli amminoacidi desiderati nella sequenza appropriata, tutti i gruppi protettivi rimanenti (e tutto il supporto solido) vengono tagliati in sequenza o simultaneamente, generando il peptide finale. Attraverso una semplice modifica di questa procedura generale, è possibile aggiungere più di un amminoacido per volta ad una catena in crescita, ad esempio accoppiando (sotto condizioni che non racemizzano i centri chirali) un tripeptide protetto con un dipeptide opportunamente protetto, così da formare, in seguito alla deprotezione, un pentapeptide (condensazione di segmenti).
Un metodo particolarmente preferito per preparare i presenti derivati di GLP-2 prevede una sintesi di peptidi in fase solida in cui l'amminoacido α-N-terminale viene protetto con un gruppo sensibile agli acidi o alle basi. Tali gruppi protettivi dovrebbero avere le proprietà di essere stabili alle condizioni di formazione dei legami peptidici, essendo allo stesso tempo facili da rimuovere senza distruggere la catena peptidica in crescita, o senza racemizzare alcuno dei centri chirali contenuti al suo interno. Esempi di gruppi protettivi per N e di gruppi protettivi per carbossi sono divulgati in Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, New York, pagg. 152-186 (1981)). Esempi di gruppi protettivi per N comprendono, senza limitazioni, gruppi alcanoile inferiori come formile, acetile ("Ac"), propionile, pivaloile, t-butilacetile e similari; altri gruppi acile comprendono 2-cloroacetile, 2-bromoacetile, trifluoroacetile, tricloroacetile, ftalile, o-nitrofenossiacetile, clorobutirrile, benzoile, 4-clorobenzoile, 4-bromobenzoile, 4-nitrobenzoile e similari; gruppi solfonile come benzensolfonile, p-toluensolfonile, o-nitrofenilsolfonile, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-solfonile (pmc), e similari; gruppi formanti carbammato come t-amilossicarbonile, benzilossicarbonile, p-clorobenzilossicarbonile, p-metossibenzilossicarbonile, p-nitrobenzilossicarbonile, 2-nitrobenzilossicarbonile, p-bromobenzilossicarbonile, 3,4-dimetossibenzilossicarbonile, 3,5-dimetossibenzilossicarbonile, 2,4-dimetossibenzilossicarbonile, 4-etossibenzilossicarbonile, 2-nitro-4,5-dimetossibenzilossicarbonile, 3,4,5-trimetossibenzilossicarbonile, 1-(p-bifenilil)-1-metiletossicarbonile, α,α-dimetil-3,5-dimetossibenzilossicarbonile, benzidrilossicarbonile, t-butilossicarbonile (boc), diisopropilmetossicarbonile, isopropilossicarbonile, etossicarbonile, metossicarbonile, allilossicarbonile, 2,2,2,-tricloroetossicarbonile, fenossicarbonile, 4-nitrofenossicarbonile, fluorenil-9-metossicarbonile, isobornilossicarbonile, ciclopentilossicarbonile, adamantilossicarbonile, cicloesilossicarbonile, feniltiocarbonile e similari; gruppi arilalchile come benzile, bifenilisopropilossicarbonile, trifenilmetile, benzilossimetile, 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc) e similari, e gruppi silile come trimetilsilile e similari. Gruppi protettivi preferiti per α-N sono o-nitrofenilsolfenile; 9-fluorenilmetilossicarbonile; t-butilossicarbonile (boc), isobornilossicarbonile; 3,5-dimetossibenzilossicarbonile; t-amilossicarbonile; 2-ciano-t-butilossicarbonile, e similari, essendo maggiormente preferito 9-fluorenil-metilossicarbonile (Fmoc), mentre gruppi protettivi per N di catena laterale comprendono 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-solfonile (pmc), nitro, p-toluensolfonile, 4-metossibenzensolfonile, Cbz, Boc, e adamantilossicarbonile per gruppi ammino di catena laterale come lisina e arginina; benzile, o-bromobenzilossicarbonile, 2,6-diclorobenzile, isopropile, t-butile (t-Bu), cicloesile, ciclopenile e acetile (Ac) per la tirosina; t-butile, benzile e tetraidropiranile per la serina; tritile, benzile, Cbz, p-toluensolfonile e 2,4-dinitrofenile per l'istidina; formile per il triptofano; benzile e t-butile per acido aspartico e acido glutammico; e trifenilmetile (tritile) per la cisteina.
Un gruppo protettivo per carbossi indica convenzionalmente un gruppo estere o ammide di protezione per un acido carbossilico. Tali gruppi protettivi per carbossi sono ben noti agli esperti del ramo, essendo stati estensivamente usati per la protezione di gruppi carbossile nei rami delle penicilline e delle cefalosporine, come descritto in US 3.840.556 e 3.719.667. Gruppi protettivi rappresentativi per carbossi comprendono, senza limitazioni, un alchile inferiore C1-C8; un arilalchile come fenetile o benzile, e loro derivati sostituiti come gruppi alcossibenzile o nitrobenzile; un arilalchenile come feniletenile; arile e suoi derivati sostituiti come 5-indanile; un dialchilamminoalchile come dimetilamminoetile; gruppi alcanoilossialchile come acetossimetile, butirrilossimetile, valerilossimetile, isobutirrilossimetile, isovalerilossimetile, 1-(propionilossi)-1-etile, 1-(pivaloilossil)-1-etile, 1-metil-1-(propionilossi)-1-etile, pivaloilossimetile, propionilossimetile; gruppi cicloalcanoilossialchile come ciclopropilcarbanilossimetile, ciclobutilcarbonilossimetile, ciclopentilcarbonilossimetile, cicloesilcarbonilossimetile; un aroilossialchile come benzoilossimetile, benzoilossietile; un arilalchilcarbonilossialchile come benzilcarbonilossimetile, 2-benzilcarbonilossietile; un alcossicarbonilalchile o cicloalchilossicarbonilalchile come metossicarbonilmetile, cicloesilossicarbonilmetile, 1-metossicarbonil-1-etile; un alcossicarbonilossialchile o cicloalchilossicarbonilossialchile come metossicarbonilossimetile, t-butilossicarbonilossimetile, 1-etossicarbonilossi-1-etile, 1-cicloesilossicarbonilossi-1-etile; un arilossicarbonilossialchile come 2-(fenossicarbonilossi)etile, 2-(5-indanilossicarbonilossi)-etile; un alcossialchilcarbonilossialchile come 2-(1-metossi-2-metilpropan-2-oilossi)-etile; un arilalchilossicarbonilossialchile come 2-(benzilossicarbonilossi)etile; un arilalchenilossicarbonilossialchile come 2-(3-fenilpropen-2-ilossicarbonilossi)etile; un alcossicarbonilamminoalchile come t-butilossicarbonilamminometile; un alchilamminocarbonilamminoalchile come metilamminocarbonilamminometile; un alcanoilamminoalchile come acetilamminometile; un carbonilossialchile eterociclico come 4-metilpiperazinilcarbonilossimetile; un dialchilamminocarbonilalchile come dimetilamminocarbonilmetile, dietilamminocarbonilmetile; un (5-(alchile inferiore)-2-osso-1,3-diossolen-4-il)alchile come (5-t-butil-2-osso-1,3-diossolen-4-il)metile; e un (5-fenil-2-osso-1,3-diossolen-4-il)alchile come (5-fenil-2-osso-1,3-diossolen-4-il)metile. Gruppi protettivi rappresentativi di ammide per carbossi comprendono, senza limitazioni, gruppi amminocarbonile e (alchile inferiore)amminocarbonile. Dei suddetti gruppi protettivi per carbossi, sono preferiti un estere di alchile inferiore, cicloalchile o arilalchile, ad esempio metil estere, etil estere, propil estere, isopropil estere, butil estere, sec-butil estere, isobutil estere, amil estere, isoamil estere, ottil estere, cicloesil estere, feniletil estere e similari, o un estere di alcanoilossialchile, cicloalcanoilossi-alchile, aroilossialchile o arilalchilcarbonilossialchile. Gruppi protettivi preferiti di ammide per carbossi sono i gruppi (alchile inferiore)amminocarbonile.
Nel metodo di sintesi peptidica in fase solida, l'amminoacido α-C-terminale è fissato ad un adatto supporto solido o resina. Adatti supporti solidi utili nella sintesi succitata sono quei materiali che sono inerti ai reagenti e alle condizioni di reazione delle reazioni passo-passo di condensazione-deprotezione, e che sono insolubili nei mezzi usati. Il supporto solido preferito per la sintesi di peptidi con carbossi α-C-terminale è la resina 4-idrossimetilfenossiacetil-4'-metilbenziidrilammina (resina HMP). Il supporto solido preferito per i peptidi con ammide α-C-terminale è la resina Ramage protetta con Fmoc.
Quando il supporto solido è una resina di 4-(2',4'-dimetossifenil-Fmoc-amminometil)-fenossi-acetammidoetile, il gruppo Fmoc viene tagliato con un'ammina secondaria, preferibilmente piperidina, prima dell'accoppiamento con l'amminoacido α-C-terminale, come descritto sopra. Il metodo preferito per accoppiare la resina di 4-(2',4'-dimetossifenil-Fmoc-amminometil)-fenossi-acetammidoetile deprotetta consiste nell'utilizzo di O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronioesafluoro-fosfato (HBTU, 1 equiv.), diisopropiletilammina (DIEA, 1 equiv.), e opzionalmente 1-idrossibenzotriazolo (HOBT, 1 equiv.), in DMF. L'accoppiamento degli amminoacidi protetti successivi può essere condotto in un sintetizzatore automatico per polipeptidi, in una maniera convenzionale ben nota nel ramo.
La rimozione del gruppo protettivo Fmoc dal lato α-N-terminale del peptide in crescita viene condotta in maniera convenzionale, ad esempio mediante trattamento con un'ammina secondaria, preferibilmente piperidina. Ciascun amminoacido protetto viene quindi introdotto in un eccesso molare di circa 3 volte, e l'accoppiamento viene preferibilmente eseguito in DMF. Normalmente, l'agente di accoppiamento è O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronioesafluorofosfato (HBTU, 1 equiv.), diisopropil-etilammina (DIEA, 1 equiv.), e opzionalmente 1-idrossibenzotriazolo (HOBT, 1 equiv.).
Al termine della sintesi in fase solida, il peptide viene rimosso dalla resina e deprotetto, in operazioni successive o in una singola operazione. La rimozione del polipeptide e la deprotezione possono essere convenzionalmente condotte in una singola operazione, trattando il polipeptide legato alla resina con un reagente di taglio, tra cui tioanisolo, triisopropilsilano, fenolo, e acido trifluoracetico. Nei casi in cui l'α-C-terminale del polipeptide è un'alchilammide, la resina viene tagliata per amminolisi con un'alchilammina. In alternativa, il peptide può essere rimosso mediante trans-esterificazione, ad esempio con metanolo, seguita da amminolisi, o mediante trans-ammidazione diretta. A questo punto, il peptide protetto può essere purificato o portato direttamente al passaggio successivo. La rimozione dei gruppi protettivi per catene laterali viene condotta usando la miscela di scissione sopra descritta. Il peptide completamente deprotetto può essere purificato con una sequenza di passaggi cromatografici, usando qualsiasi o la totalità dei seguenti passaggi: scambio ionico su una resina debolmente basica (forma acetata); cromatografia idrofoba di assorbimento su polistirene-divinilbenzene non funzionalizzato (come Amberlite XAD™); cromatografia di assorbimento su gel di silice; cromatografia di scambio ionico su carbossimetilcellulosa; cromatografia di ripartizione, ad esempio su Sephadex G-25™, LH-20™ o con distribuzione in controcorrente; cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC), in particolare una HPLC in fase inversa con impaccamento su colonna a fase legata di ottil-silice od ottadecilsilil-silice. Qualsiasi persona avente una conoscenza ordinaria del ramo sarà in grado di determinare facilmente quali sarebbero le sequenze o i passaggi cromatografici preferiti che sono necessari ad ottenere una purificazione accettabile del peptide GLP-2.
I pesi molecolari di questi peptidi vengono determinati utilizzando una spettroscopia di massa in elettrospray a quadrupolo.
Il processo di sintesi per la produzione dei derivati di GLP-2 della presente invenzione varierà in grande misura, a seconda della natura dei vari elementi, ovvero la sequenza di GLP-2, il gruppo di legame e l'entità reattiva, che costituiscono il derivato di GLP-2. Le procedure di sintesi sono selezionate in modo tale da garantire semplicità, rese elevate e riproducibilità, nonché per permettere di ottenere un prodotto altamente purificato. Normalmente, l'entità chimicamente reattiva verrà accoppiata nell'ultimo stadio della sintesi, ad esempio con un gruppo carbossile per esterificazione, in modo da formare un estere attivo. A seguire sono descritti metodi specifici per la produzione dei presenti derivati di GLP-2.
Risulta imperativa la collocazione dell'entità chimicamente reattiva in un sito che consenta al peptide di legarsi in modo covalente al componente ematico, pur trattenendo una quota sostanziale, se non la totalità, dell'attività e/o degli effetti benefici del peptide GLP-2 nativo corrispondente.
I derivati di GLP-2 possono essere somministrati a pazienti che trarrebbero beneficio da una crescita di tessuto del tratto gastrointestinale superiore. Sono candidati per il trattamento con l'invenzione anche pazienti che trarrebbero beneficio da una migliore funzione tissutale del tratto gastrointestinale superiore, sia essa o meno la conseguenza di una crescita aumentata di tessuto. In generale, sono candidati per il trattamento con i presenti derivati peptidici di GLP-2 i pazienti che trarrebbero beneficio da una massa aumentata del tratto gastrointestinale superiore e/o da una migliore funzione della mucosa del tratto gastrointestinale superiore. Particolari condizioni che possono essere trattate con i presenti derivati peptidici di GLP-2 comprendono le varie forme di malattie infiammatorie dello stomaco o dell'esofago, oltre che pazienti che hanno subito una resezione parziale o sub-totale del tratto gastrointestinale superiore. Un elenco non esaustivo di condizioni del tratto gastrointestinale superiore, comprendente lo stomaco e l'esofago, che possono essere trattate con i presenti derivati di GLP-2, o con loro miscele, includono disordini dello stomaco come gastrite acuta, gastrite emorragica acuta, gastrite acuta da stress, gastrite virale, gastrite parassitaria, gastrite fungina, gastropatia (acuta), gastropatia emorragica, gastrite acuta da helicobacter pylori, gastrite di tipo A, B o C, gastrite ipersecretoria, gastrite aspecifica secondaria a Helicobacter pylori, gastrite associata a Helicobacterpylori, gastrite chimica, gastrite reattiva, gastrite da reflusso, gastrite biliare, gastrite atrofica metaplastica e gastrite atrofica metaplastica ambientale, pangastrite idiopatica, gastrite corporea diffusa, gastrite cronica autoimmune e gastrite autoimmune-associata, gastrite da batteri diversi da helicobacter pilori (Gastrospirillum hominis, phlegmonous, micobatterio, sifilide), gastrite atrofica post-antrectomia, gastrite eosinofila, e qualsiasi altra gastrite acuta infettiva; morbo di Crohn, sarcoidosi, gastrite granulomatosa isolata, gastrite linfocitica, sindrome di Menetrier, ecc., e disordini dell'esofago come esofagite infettiva da funghi quali specie Candida (specialmente albicans), sp. Aspargillus, Histoplasma capsulatwn, Blastomyces dermatitides, da virus come virus herpes simplex (tipo 1), citomegalovirus, virus Varicella-zoster, o da batteri come Mycobacterium tuberculosis, Actinomyces Israelii, Streptococcus viridans, Lactobacillus acidophilus e Treponema pallidum. Altri disordini dell'esofago comprendono, senza limitazioni, esofagite non infettiva, reflusso di acido, reflusso di bile, danno chimico (causato da medicine, tossine, acidi, alcali, ecc.), sarcoidosi, morbo di Crohn, malattia di Behcet, malattia del trapianto contro l'ospite, infezioni correlate all'AIDS, sp. Cryptosporidium, sp. Microsporidium, Isospora beill, Glardia Lamblia, sp. Salmonella, sp. Shigella, sp. Campylobacter, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Clostridium difficile, Cytomeglavorius, ed Herpes simplex.
Altre malattie o condizioni che possono essere trattate con i presenti derivati peptidici di GLP-2 includono anomalie nella mucosa del tratto intestinale tenue, che comprendono ulcere e disordini infiammatori; disordini congeniti o acquisiti di digestione e assorbimento, comprese le sindromi da malassorbimento; e malattie e condizioni causate da una perdita di funzione della mucosa dell'intestino tenue, in particolare nei pazienti che ricevono un'alimentazione parenterale prolungata o nei soggetti che, in seguito ad un intervento chirurgico, hanno subito una resezione dell'intestino tenue e soffrono della sindrome da intestino corto e della sindrome da cul-de-sac. In generale, sono candidati per il trattamento con i derivati peptidici di GLP-2 i pazienti che trarrebbero beneficio da una massa aumentata dell'intestino tenue, e da una conseguente funzione migliorata della mucosa dell'intestino tenue. Particolari condizioni che possono essere trattate con i presenti derivati di GLP-2 includono le varie forme di sprue, tra cui la sprue celiaca, provocata da una reazione tossica nei confronti della gliadina del frumento, e caratterizzata da una massiccia perdita di villi dell'intestino tenue; la sprue tropicale, provocata da un'infezione e caratterizzata da un appiattimento parziale dei villi; la sprue ipogammaglobulinemica, comunemente osservata in pazienti affetti da immunodeficienza comune variabile o ipogamma-globulinemia, e caratterizzata da una riduzione significativa dell'altezza dei villi. Altre condizioni che possono essere trattate con i presenti derivati, o per le quali possono essere utili a livello profilattico, comprendono enterite da radiazione, enterite infettiva o post-infettiva, enterite regionale (morbo di Crohn), danno dell'intestino tenue causato da agenti tossici o da altri agenti chemioterapeutici, e pazienti affetti dalla sindrome dell'intestino corto.
In un altro aspetto, pazienti candidati per il trattamento con i presenti derivati peptidici di GLP-2 sono coloro che trarrebbero beneficio dalla crescita di isole pancreatiche, e in particolare dalla proliferazione o rigenerazione di isole pancreatiche. Tali pazienti comprendono quelli affetti da malattie o condizioni caratterizzate dall'assenza o riduzione delle isole pancreatiche, o da una funzione ridotta delle isole pancreatiche. Pazienti candidati particolari sono quelli affetti da diabete di tipo 1 o 2, insieme a pazienti con forme secondarie di diabete dovute a infiltrazione, infiammazione o distruzione del pancreas.
I presenti derivati di GLP-2 possono essere usati da soli o in combinazione, allo scopo di ottimizzare i loro effetti terapeutici. Essi possono essere somministrati in un mezzo fisiologicamente accettabile, ad esempio acqua deionizzata, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), soluzione salina, etanolo acquoso o un altro alcol, plasma, soluzioni proteinacee, mannitolo, glucosio acquoso, alcol, olio vegetale, o similari. Altri additivi che possono essere inclusi comprendono tamponi, dove i mezzi vengono generalmente tamponanti su un pH nel campo tra circa 5 e 10, nel qual caso un tampone varierà generalmente tra circa 50 e 250 mM in termini di concentrazione, un sale, nel qual caso la concentrazione del sale varierà generalmente tra circa 5 e 500 mM, stabilizzanti fisiologicamente accettabili, e similari. Le composizioni possono essere liofilizzate per convenienza di conservazione e trasporto.
I presenti derivati peptidici possono essere somministrati per via orale, parenterale, ad esempio intravascolare (IV), intraarteriale (IA), intramuscolare (IM), sottocutanea (SC), o similare. In situazioni adatte, la somministrazione può avvenire per trasfusione. In alcuni casi dove la reazione del gruppo funzionale è relativamente lenta, la somministrazione può avvenire per via orale, nasale, rettale, transdermica o per aerosol, laddove la natura del coniugato permette il suo trasferimento al sistema vascolare. Verrà solitamente impiegata una singola iniezione, benché, all'occorrenza, sia possibile utilizzare più di una iniezione. Il derivato peptidico può essere somministrato con qualsiasi mezzo conveniente, tra cui una siringa, un trequarti, un catetere, o similare. La particolare modalità di somministrazione varierà a seconda della quantità da somministrare, del fatto che la somministrazione avvenga in un singolo bolo o sia continua, o similare. Preferibilmente, se il sito di introduzione non è critico per questa invenzione, la somministrazione avverrà per via intravascolare, preferibilmente in un sito dove è presente un flusso rapido di sangue, ad esempio per via intravenosa in una vena periferica o centrale. Altre vie possono trovare uso quando la somministrazione è accoppiata con tecniche di rilascio lento o con una matrice protettiva. L'intento è quello di distribuire con efficacia i peptidi nel sangue, così da essere in grado di reagire con i componenti ematici. La concentrazione del coniugato varierà in ampia misura, trovandosi generalmente nel campo da circa 1 pg/ml a 50 mg/ml. Tipicamente, la dose totale somministrata per via intramuscolare può generalmente essere nel campo da circa 0,1 mg/ml a circa 10 mg/ml, più solitamente da circa 1 mg/ml a circa 5 mg/ml.
Attraverso il legame a componenti di lunga durata del sangue, come immunoglobulina, albumina di siero, eritrociti e piastrine, viene garantita una pluralità di vantaggi. L'attività dei presenti derivati di GLP-2 è prolungata per giorni, e potenzialmente fino a settimane. Durante questo periodo di tempo, è necessario fornire soltanto una singola somministrazione. È possibile ottenere una maggiore specificità, poiché il composto attivo sarà principalmente legato a grandi molecole, dove è minore la probabilità che venga assorbito per via intracellulare, andando a interferire con altri processi fisiologici.
L'attività di GLP-2 e/o la presenza dei derivati di GLP-2 possono essere monitorati nel sangue dell'ospite mammifero. Prelevando un campione di sangue dall'ospite in tempi differenti, è possibile determinare se il peptide GLP-2 si sia legato ai componenti ematici di lunga durata in una quantità sufficiente ad essere terapeuticamente attivo, e, di conseguenza, il livello di GLP-2 nel sangue. Se desiderato, è anche possibile determinare a quale, tra i componenti ematici, si è legato in modo covalente il peptide GLP-2. Per specifici peptidi sostituiti con maleimmide, è molto più semplice calcolare l'emivita dell'albumina di siero e della IgG. Il monitoraggio può anche avvenire usando saggi di attività peptica, HPLC-MS, o anticorpi diretti contro i peptidi.
Sono descritti metodi per determinare la concentrazione del peptide GLP-2 o di un suo coniugato in campioni biologici (come il sangue), usando anticorpi specifici per il peptide GLP-2, e l'uso di tali anticorpi come trattamento di una tossicità potenzialmente associata a tale peptide GLP-2 o coniugato. Ciò è vantaggioso in quanto la maggiore stabilità e vita del peptide GLP-2 in vivo nel paziente potrebbero causare nuovi problemi durante il trattamento, incluso un rischio aumentato di tossicità. L'uso di anticorpi anti-GLP-2, sia monoclonali che policlonali, aventi specificità per GLP-2, può aiutare a mediare qualsiasi di questi problemi. L'anticorpo può essere generato o derivato da un ospite immunizzato con il particolare derivato di GLP-2, o con un frammento immunogenico dell'agente, o con un immunogeno sintetizzato corrispondente ad un determinante antigenico dell'agente. Gli anticorpi preferiti avranno un'alta specificità e affinità per forme native, funzionalizzate e coniugate del derivato peptidico di GLP-2. Tali anticorpi possono anche essere marcati con enzimi, fluorocromi o radiomarcatori.
La produzione di anticorpi specifici per i derivati di GLP-2 può essere condotta utilizzando peptidi GLP-2 purificati per indurre anticorpi specifici per il GLP-2 funzionalizzato. Con induzione di anticorpi si intende non solo la stimolazione di una risposta immune mediante iniezione in animali, ma anche passaggi analoghi di produzione di anticorpi sintetici o di altre specifiche molecole di legame, come lo screening di librerie di immunoglobuline ricombinanti. Sia gli anticorpi monoclonali che gli anticorpi policlonali possono essere prodotti con procedure ampiamente note nel ramo.
Gli anticorpi possono anche essere usati per monitorare la presenza del peptide GLP-2 nel flusso sanguigno. Campioni di sangue e/o siero possono essere analizzati in SDS-PAGE e western blot. Tali tecniche permettono l'analisi del sangue o del siero per determinare il legame del derivato di GLP-2 a componenti ematici.
Gli anticorpi anti-agente terapeutico possono anche essere usati per trattare una tossicità indotta dalla somministrazione del derivato di GLP-2, e possono essere usati ex vivo o in vivo. I metodi ex vivo comprenderebbero un trattamento di immuno-dialisi per la tossicità, basato sull'utilizzo di anticorpi anti-agente terapeutico fissati a supporti solidi. I metodi in vivo comprendono la somministrazione di anticorpi anti-agente terapeutico in quantità efficaci a indurre lo smaltimento dei complessi anticorpo-agente.
Gli anticorpi possono essere usati per rimuovere i derivati di GLP-2 e loro coniugati dal sangue di un paziente ex vivo, mettendo in contatto il sangue con gli anticorpi sotto condizioni sterili. Ad esempio, gli anticorpi possono essere fissati, o comunque immobilizzati, su una matrice di colonna, e il sangue del paziente può essere rimosso dal paziente e fatto passare sopra la matrice. I derivati di GLP-2 si legheranno agli anticorpi, e il sangue contenente una bassa concentrazione di GLP-2 può essere quindi restituito al sistema circolatorio del paziente. La quantità rimossa del derivato di GLP-2 può essere controllata regolando la pressione e la portata. È possibile effettuare una rimozione preferenziale del derivato di GLP-2 dalla componente sierosa del sangue di un paziente, ad esempio, utilizzando una membrana semipermeabile, o comunque prima separando la componente sierosa dalla componente cellulare attraverso modi noti nel ramo, e quindi facendo passare la componente sierosa sopra una matrice contenente gli anticorpi anti-agente terapeutico. In alternativa, la rimozione preferenziale di cellule ematiche coniugate a GLP-2, eritrociti inclusi, può essere effettuata raccogliendo e concentrando le cellule ematiche nel sangue del paziente, e mettendo in contatto quelle cellule con anticorpi anti-GLP-2 fissati, fino all'esclusione della componente sierosa del sangue del paziente.
Gli anticorpi anti-GLP-2 possono essere somministrati in vivo, per via parenterale, ad un paziente che ha ricevuto il derivato di GLP-2 o suoi coniugati per il trattamento. Gli anticorpi legheranno il derivato di GLP-2 e i suoi coniugati. Una volta legati, l'attività di GLP-2 verrà ostacolata, se non completamente bloccata, abbassando così la concentrazione biologicamente efficace del derivato di GLP-2 nel flusso sanguigno del paziente, e riducendo al minimo gli effetti collaterali dannosi. Come se non bastasse, il complesso anticorpo-GLP-2 legato faciliterà lo smaltimento del derivato di GLP-2 e dei suoi coniugati dal flusso sanguigno del paziente.
I seguenti esempi sono forniti per illustrare forme di realizzazione preferite dell'invenzione, e non devono essere interpretati come una limitazione del suo ambito, in alcuna maniera. Se non indicato diversamente, sono stati usati amminoacidi otticamente attivi protetti nella configurazione L.
Sintesi
La sintesi dei peptidi di GLP-2 e di loro derivati è stata condotta usando una procedura automatizzata in fase solida su un sintetizzatore di peptidi Symphony™, con intervento manuale durante la generazione dei derivati di GLP-2. La sintesi è stata condotta su una resina legante ammidi Ramage™ protetta con Fmoc, usando amminoacidi protetti con Fmoc. L'accoppiamento è stato ottenuto usando O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio esafluorofosfato (HBTU) come attivatore, in una soluzione di N,N-dimetilformammide (DMF), e diisopropiletilammina (DIEA) come base. Il gruppo protettivo Fmoc è stato rimosso usando piperidina 20%/DMF. Quando necessario, sull'N-terminale è stato usato un amminoacido protetto con Boc per generare il terminale Nα libero in seguito al taglio del peptide dalla resina. Se non diversamente indicato, tutti gli amminoacidi usati durante la sintesi possedevano la stereochimica L. I recipienti di reazione di vetro usati durante la sintesi erano Sigmacoted™.
Esempio 1 (non dell'invenzione rivendicata)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-De-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Passaggio 1: La sintesi del peptide in fase solida è stata condotta in scala di 100 µmoli. Alla resina sono stati aggiunti, in sequenza, i seguenti amminoacidi protetti: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OR, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Boc)-OH. Essi sono stati dissolti in N,N-dimetilformammide (DMF) e, a seconda della sequenza, attivati usando O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N-tetrametil-uronio esafluoro-fosfato (HBTU) e diisopropiletilammina (DIEA). La rimozione del gruppo protettivo Fmoc è stata raggiunta usando una soluzione di piperidina 20% (V/V) in N,N-dimetilformammide (DMF) per 20 minuti.
Passaggio 2: Il peptide è stato tagliato dalla resina usando TFA 85%/TIS 5%/tioanisolo 5% e fenolo 5%, seguito da precipitazione con Et2O raffreddato in ghiaccio secco (0-4°C). Il peptide grezzo è stato raccolto su un imbuto di polipropilene sinterizzato, essiccato, ridissolto in una miscela 40% di acetonitrile in acqua (TFA 0-1%) e liofilizzato, generando il corrispondente materiale grezzo usato nel processo di purificazione.
Esempio 2 (non dell'invenzione rivendicata)
MPA-His-Ala-Asp-Gly-Set-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Pbe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Passaggio 1: La sintesi del peptide in fase solida è stata condotta in scala di 100 µmoli. Alla resina sono stati aggiunti, in sequenza, i seguenti amminoacidi protetti: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Emoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmov-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, MPA-OH.
Passaggio 2: Questo passaggio è stato condotto nello stesso modo del passaggio 2 dell'esempio 1.
Esempio 3 (non dell'invenzione rivendicata)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2
Passaggio 1: Questo passaggio è stato condotto nello stesso modo del passaggio 1 dell'esempio 1 che precede, eccetto per il fatto che il primo amminoacido aggiunto alla resina è stato Fmoc-Lys(Aloc)-OH.
Passaggio 2: La deprotezione selettiva del gruppo Lys(Aloc) è stata eseguita manualmente, ed è stata condotta trattando la resina con una soluzione di 3 eq di Pd(PPh3)4 dissolti in 5 mL di C6H6 : CHCl3 (1:1) : NMM 2,5% (v:v) : AcOH 5% (v:v), per 2 ore. La resina è stata quindi lavata con CHCl3 (6 x 5 mL), AcOH 20% in DCM (6 x 5 mL), DCM (6 x 5 mL), e DMF (6 x 5 mL).
Passaggio 3: La sintesi è stata poi nuovamente automizzata per l'aggiunta dell'acido 3-maleimmidopropionico. Tra ciascun accoppiamento, la resina è stata lavata 3 volte con N,N-dimetilformammide (DMF), e 3 volte con isopropanolo.
Passaggio 4: Il peptide è stato tagliato dalla resina usando TFA 85%/TIS 5%/tioanisoli 5% e fenolo 5%, seguito da precipitazione con Et2O raffreddato in ghiaccio secco (0-4°C). Il peptide grezzo è stato raccolto su un imbuto di polipropilene sinterizzato, essiccato, ridissolto in una miscela 40% di acetonitrile in acqua (TFA 0,1%) e liofilizzato, generando il corrispondente materiale grezzo usato nel processo di purificazione.
Esempio 4 (non dell'invenzione rivendicata)
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Lys(MPA)-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Passaggio 1: La sintesi del peptide in fase solida è stata condotta in scala di 100 µmoli. Osservando la procedura descritta nel passaggio 1 dell'esempio 1, alla resina sono stati aggiunti, in sequenza, i seguenti amminoacidi protetti: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH-OH, Boc-His(Boc)-OH.
Passaggi 2-4: Questi passaggi sono stati condotti nello stesso modo dei passaggi 2-4 dell'esempio 3.
Esempio 5 (non dell'invenzione rivendicata)
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Sez-Phe-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-CONH2
Passaggio 1: La sintesi del peptide in fase solida è stata condotta in scala di 100 µmoli. Osservando la procedura descritta nel passaggio 1 dell'esempio 1, alla resina sono stati aggiunti, in sequenza, i seguenti amminoacidi protetti: Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH,
Da Inglese a Italiano: Spreading Codes For A Satellite Navigation System (by EUROPEAN SPACE AGENCY FR) General field: Legale/Brevetti Detailed field: Brevetti
Testo originale - Inglese Description
Field of the Invention
[0001] The present invention relates to the generation and use of spreading codes for a satellite navigation system.
Background of the Invention
[0002] Satellite navigation systems are becoming increasingly important in a wide range of applications, including handheld devices for position determination, in-car navigation support, and so on. The main satellite navigation system in service at present is the global positioning system (GPS) operated by the United States Department of Defense. Worldwide sales of GPS equipment reached nearly 3.5 billion dollars by 2003, and this figure is expected to grow steadily over the next few years. A European counterpart satellite navigation system, named Galileo, is planned for launch and service availability later this decade.
[0003] A satellite navigation system comprises a constellation of satellites that each broadcasts one or more signals to earth. The basic components of a satellite signal are a spreading code (also referred to as a positioning, synchronisation or ranging code) which is combined with navigation data. The resulting combination is then modulated onto a carrier at a set frequency for transmission to earth. Each satellite generally transmits at multiple frequencies, which can help to compensate for any atmospheric distortion.
[0004] In some cases, multiple signals (referred to as channels) may be modulated onto a single carrier via some appropriate multiplexing scheme. For example, it is planned for certain Galileo signals to comprise a data channel in phase quadrature with a pilot channel. The pilot channel contains only a spreading code, but no navigation data, while the data channel contains both the spreading code and the navigation data.
[0005] The spreading code component of a satellite signal typically comprises a predetermined sequence of bits (sometimes referred to as 'chips') and is used to perform two main tasks. Firstly, the spreading code provides a synchronisation mechanism to allow a receiver to lock onto a satellite signal. Thus each satellite (and typically each channel broadcast from that satellite) has its own synchronisation code. When a receiver is first switched on, it does not know which satellite signals can be received, since certain satellites in the constellation will be below the horizon for that particular location at that particular time. The receiver uses the synchronisation codes to lock into a signal from a first satellite. Once this has been done, the navigation data in the signal can be accessed. This then provides ephemeris data for the other satellites in the constellation, and allows the remaining satellites that are visible to the receiver to be acquired relatively quickly.
[0006] Many receivers employ a two-phase acquisition process. In the first phase, the receiver performs a simultaneous cross-correlation of the incoming signal against the set of all possible signals. This searches for a signal from any satellite, with any possible timing offset between the satellite and the receiver, and with any possible Doppler shift between the satellite and the receiver (which is dependent on the motion of the satellite in space). If a cross-correlation is found to exceed a predetermined threshold, then a second phase involving a more detailed analysis is performed for the relevant combination of satellite, timing offset and Doppler shift. This second-phase analysis may, for example, involve a longer integration time, an attempt to access and decode the navigation data, etc, in order to confirm that a correct acquisition has been made.
[0007] The second main task of a spreading code is to provide a distance estimate from the satellite to the receiver, based on the time that it has taken the signal to travel from the satellite to the receiver, which can be expressed as: c(Tr-Ts), where:
c is the velocity of light (known, subject to ionospheric effects, etc),
Ts is the time of sending from the satellite, which is encoded into the signal itself, and
Tr is the time of signal receipt at the receiver.
[0008] The position of the receiver can then be determined in three-dimensional space by using a process of trilateration, given the known positions of the satellites (as specified in their navigation data). In theory, this can be performed with signal information from a minimum of three satellites. In practice however we can write Tr = Tm o, where Tm is the measured time of receipt at the receiver, and o is the offset between the receiver clock and satellite clock, which is generally unknown, except for specialised receivers. This then implies that signal information is obtained from at least one additional satellite to compensate for the unknown time offset at the receiver. If signals from further satellites are available, a statistical position determination can be performed using any appropriate algorithm such as least squares. This can also provide some indication of the error associated with an estimated position.
[0009] One important parameter for the spreading code is the bit rate at which the spreading code is transmitted, since this in turn controls the accuracy with which the positional determination can be made. For example, with a bit rate of 1 MHz, each bit represents a light travel time of 300 metres. The positioning accuracy is then determined by how accurately the phase offset between the satellite and the receiver can be judged for a single bit. This is generally dependent upon the noise in the system. For example, if the phase offset can be measured to an accuracy of 90 degrees (π/2), this corresponds to a positional determination of 75 metres. It will be appreciated that having a higher bit rate for the spreading code allows more accurate position determinations to be made.
[0010] Another important parameter for the spreading code is its total length, in other words the number of bits or chips in the spreading code before it repeats. One reason for this is that the finite length of the spreading code can lead to ambiguity in the position determination. For example, assume that the bit rate is 10 MHz and the total length of the bit sequence is 256 bits, which therefore corresponds to a light travel time of 7.68 km. As a result, the distance measurement from the satellite to the receiver is not uniquely specified, but rather can only be expressed as 7.68n d km, where d is determined by the relative timing of the spreading code as broadcast and as received, but n is an unknown integer. There are various ways in which the ambiguity as to the value of n can be resolved, including using signals from a larger number of satellites, or by using knowledge of an approximate position derived from some other source. One common approach is to relate the code phase to the bit edge of the navigation data bit (this process is called bit synchronization), and also to relate the bit edge to the time of week (ToW) contained in the navigation data transmitted by the satellite.
[0011] It will be appreciated that increasing the repetition length for the spreading code helps to reduce problems with ambiguous distance determinations. A longer length for the spreading code also provides better separation of signals from different sources, and increased robustness against interference. On the other hand, having a longer repetition length for the spreading code may delay initial acquisition of the signal, as well as requiring more processing capability within the receiver. The length of the spreading code also impacts the data rate that can be used for the navigation data, since there is normally only one bit of navigation data for each complete spreading code sequence (otherwise the two would interfere). Therefore, the longer the repetition length for the spreading code, the lower the bit rate for the navigation data.
[0012] One known strategy to counter this problem is to use a hierarchical or tiered spreading code based on primary and secondary codes. If we assume that the primary code has N1 bits and the secondary code has N2 bits, then the first N1 bits of the overall spreading code correspond to the primary sequence exclusive-ORed with the first bit of the secondary code, the next N1 bits of the spreading code comprise a repeat of the N1 bits of the primary code, this time exclusive-ORed with the second bit of the secondary code, and so on. This gives a total repetition length for the code of N1xN2. However, the repetition length for synchronisation purposes is only N1, since the primary code will still give a correlation peak irrespective of the value of the bit from the secondary code (this will just change the sign of the correlation peak). Likewise, the bit rate of the navigation data is dependent on the length of the primary code alone (N1), rather than the length of the primary and secondary codes combined (N1*N2).
[0013] The GPS spreading codes are implemented using linear feedback shift registers (LFSRs), in which selected outputs from an N-stage shift register are tapped and fed back to the input. The feedback connections within the LFSR can be represented as a polynomial of order N, whereby the operation of an LFSR can be fully specified by its polynomial and the initial setting of the LFSR.
[0014] GPS uses a subset of LFSRs known as Gold codes that have certain special mathematical properties. One of these is that they generate an output of pseudo-random noise having a maximal repetition length of 2N-1, so that a relatively compact LFSR can generate an output with a long repetition length. Gold codes also have good auto-correlation properties that support accurate positioning. In particular, the autocorrelation function has a well-defined peak at zero time shift, and is relatively small for all other (i.e. non-zero) time shifts. It is also possible to select a set of Gold codes that have good cross-correlation properties, whereby the cross-correlation function between different codes is kept relatively small. This is important for signal acquisition, since it helps to prevent a synchronisation code from one satellite being accidentally mistaken for a synchronisation code from another satellite. A further important practical criterion for a spreading code is to have equal (or nearly equal) numbers of ones and zeros - this is referred to as balancing.
[0015] Additional information about satellite navigation systems, and in particular about GPS, can be found in: "Re-Tooling the Global Positioning System" by Per Enge, p64-71, Scientific American, May 2004, and in "Global Positioning System: Signals, Measurements and Performance", by Misra and Enge, Ganga-Jamuna Press, 2001, ISBN 0-9709544-0-9. Information about the proposed Galileo signals can be found in: "Status of Galileo Frequency and Signal Design" by Hein et al, September 2002, available from: http://europa.eu.int/comm/dgs/energy_transport/galileo/doc/galileo_stf_ion2002.pdf, see also "Galileo Frequency and Signal Design" by Issler et al, GPS World, Jun 2003, available from: http://www.gpsworld.com/gpsworld/article/articleDetail.jsp?id=61244. A proposed Galileo/GPS receiver is described in: "HIGAPS - A Large-Scale Integrated Combined Galileo/GPS Chipset for the Consumer Market" by Heinrichs et al, available from http://forschung.unibw-muenchen.de/papers/krc5ejjfluurjj9jsrxk4spthvmg0be.pdf.
[0016] Although the use of Gold codes is well-established for existing satellite navigation systems, there are some limitations associated with such codes. For example, they are only available with certain code lengths (not all values of N can be used for the LFSR polynomial). In general, the code length is determined by the ratio of the chip rate of the spreading code and the bit rate of the navigation data. If the code length is restricted to an available Gold code, then this implies a constraint on the chip rate and the bit rate, which might in turn impact other considerations, such as acquisition time and positioning accuracy. In some cases, the limitation on code length for Gold codes has been overcome by using truncated Gold codes, but this truncation has an adverse impact on the mathematical properties of the code set (in terms of the autocorrelation function, etc).
[0017] In addition, the cross-correlation properties of Gold codes are not generally optimised for the situation where the polarity of the code changes from one repetition of the code to the next, in accordance with the navigation data that is being transmitted. This latter problem is exacerbated where the bit rate of the navigation data is relatively high (as for Galileo), since this leads to a significant probability that a spreading code transmission has the opposite polarity from the immediately preceding transmission of the spreading code. (This is also the reason for the provision of pilot channels in Galileo, in order to aid acquisition without disruption by the navigation data).
[0018] Cross-correlation properties are also of particular concern for locations having relatively poor signal reception, such as inside a building. In this case a first signal from one satellite may be strong, for example, if there is a line of sight to the satellite through a window, while a second signal from another satellite may be substantially weaker, for example, if the line of sight to the second satellite passes through significant building structure. In this situation, if an attempt is made to acquire the second satellite, there is a risk that the correlation against the stronger but incorrect first signal may yield a greater (or similar) result than the correlation against the weaker but correct second signal. Although any resulting misidentification of the first signal as the second signal will normally be corrected later in a subsequent acquisition phase, this introduces delays, as the acquisition procedure then has to return to the first phase. If there are multiple such misidentifications, acquisition time may be increased significantly.
Summary of the Invention
[0019] Accordingly, one embodiment of the invention provides a method of creating a set of secondary spreading codes for use in a satellite navigation system comprising a constellation of satellites. Each satellite in the constellation employs a tiered spreading code comprising at least a primary code and a secondary code. Each satellite in the constellation is allocated a different secondary spreading code from the set of secondary spreading codes. The method comprises generating an initial set of bit patterns, where each bit pattern represents a potential secondary spreading code. The method further comprises performing an optimisation process on bit patterns within the initial set of bit patterns so that at least some of the bit patterns in the initial set are modified or replaced, thereby creating a final set of bit patterns for use as the set of secondary spreading codes. The optimisation process utilises a performance or cost function derived from at least one of: (a) the auto-correlation function for a bit pattern, and/or (b) the cross correlation function between different bit patterns.
[0020] The provision of different secondary codes for different satellites has been found to reduce correlation between the codes from the different satellites, and so helps with improved receiver performance. The use of an optimisation process to determine the set of secondary codes offers more flexibility than codes sets based on mathematical algorithms (such as Gold codes), for example in terms of the length of the secondary code, the number of codes available in a set, and the particular properties of the codes.
[0021] In one embodiment, the bit patterns in the initial set of bit patterns comprise random sequences of bits, although any other suitable starting patterns may be used, for example as generated by linear feedback shift registers or some other pseudo-random algorithm. Note that the use of randomly created initial bit patterns generally helps to ensure good coverage of the overall search space for potential secondary codes. During the optimisation process, the bit patterns may be modified by randomly flipping a bit in at least one of the bit patterns. For longer secondary codes it may be desirable to flip multiple bits during at least the initial part of the optimisation process in order to speed convergence, although since the secondary codes are usually relatively short (compared to the overall length of a tiered code), flipping just a single bit of the code for each iteration has generally been found to give a reasonable speed of convergence. The bit modifications may be reversed if it is found that they lead to decreased performance (thereby ensuring that the set of bit patterns does not deteriorate), although such decreased performance may be accepted on a probabilistic basis (especially if the decrease is not too great) in order to give the optimisation the ability to escape from local maxima.
[0022] It will be appreciated that there is a wide variety of known optimisation strategies, such as simulated annealing, genetic algorithms, and so on, and any suitable such strategy may be employed to create the final set of bit patterns. In some of these strategies, the optimisation may involve the generation of a larger population of bit patterns followed by selection of the best examples (e.g. survival of the fittest), while other strategies may be based on continuous modification of individual bit patterns within a predetermined set.
[0023] In one embodiment, the optimisation process includes rejecting bit patterns that fail a balance criterion, thereby ensuring that there is relatively little DC component in the codes. The balance criterion may be based on the square root of the number of bits in a bit pattern, which reflects the expected DC component for a random code. Note that in other embodiments, code balance might be included as part of the formal optimisation -i.e. the optimisation works to reduce balance, rather than simply rejecting bit patterns with a balance that is greater than a given threshold. Another possibility is that once bit patterns having good balance properties have been identified, then the optimisation process is arranged to leave the balance invariant (such as by selecting pairs of bits to flip, one being a 0 and one being a 1). Other code criteria that might be handled in a similar manner to balance include the maximum run length of a particular bit value (either one and/or zero).
[0024] The optimisation process can utilise a performance (or cost) function derived from the auto-correlation function for a bit pattern to select bit patterns that have good individual properties. A performance or cost function derived from the cross correlation function can then be used to select a group of bit patterns that in combination form a good set of codes. It will be appreciated that minimal side-lobes in the auto-correlation function lead to a better acquisition properties, for example, the signal can be acquired more easily under poor reception conditions, such as indoors and under tree foliage, while minimum cross-correlation with other codes reduces multiple access interference and intra-system noise, thereby increasing the robustness of signal acquisition, tracking, and data demodulation.
[0025] The optimisation process may include a first phase of identifying bit patterns having good individual properties, and a second phase of selecting the set of secondary spreading codes from the identified bit patterns having good individual properties. The number of bit patterns identified as having good individual properties may be significantly higher than the number of satellites in the constellation. For example, the first phase may identify a group of 250 or more bit patterns that have good individual properties. Such a group then provides a good range of choice during the second phase of the optimisation, as well as accommodating potential uses of the codes outside the satellite constellation itself - e.g. in pseudolites, as discussed in more detail below, which can lead to a requirement for a larger number of potential codes.
[0026] The use of first and second phases for the optimisation has been found to be a convenient and effective approach for performing the optimisation. However, other embodiments might only use a single phase of optimisation that is performed directly on groups of bit patterns.
[0027] In one embodiment, the second phase includes calculating the cross correlation function between every pair of identified bit patterns having good individual properties. This exhaustive search of all possible combinations has been found to be more efficient computationally than an iterative search of potential sets of bit patterns, although the latter approach might be used if appropriate (for example, if the number of identified bit patterns is very large).
[0028] In one embodiment, the number of bits in a bit pattern for a secondary code is in the range 25 to 512, more particularly in the range 50 to 128. Note that for very short secondary code lengths, the available code space can be searched exhaustively to determine a suitable set of bit patterns (rather than using a form of optimisation procedure as described herein).
[0029] Another embodiment of the invention provides a receiver incorporating a final set of bit patterns created using the above method. The bit patterns in the receiver may be protected by an error-correcting code. The receiver may have at least one read only memory (ROM) that stores the secondary code portions of the tiered spreading codes, and optionally the primary code portions as well. In some receivers, it may be possible to update this ROM, for example to reflect any changes to the spreading codes emitted from the satellites.
[0030] In some implementations, the receiver may incorporate bit patterns for at least two satellite constellations, for example Galileo and GPS. Note that the GPS spreading codes are Gold codes, and are normally generated within a receiver using a linear feedback shift register. However, the GPS codes could be stored as complete bit patterns if it is desired to have a single consistent approach to be used for multiple satellite navigation systems.
[0031] Note that there are various ways in which the bit patterns may be provided to the receiver. For example, in some embodiments the bit patterns may be pre-installed into the receiver. In some embodiments, the bit patterns may be installed (or upgraded) into the receiver via some form of removable memory device, such as flash memory. In some embodiments, the bit patterns may be installed (or upgraded) into the receiver over a network, for example by downloading over the Internet or over a mobile telephone network (the latter is particularly convenient if the receiver itself is incorporated into some form of mobile telephone device). With this latter approach, the codes need not necessarily be stored in the receiver itself, but rather may just be accessed as and when required over the network.
[0032] Accordingly another embodiment of the invention provides a method of operating a server that communicates with receivers for use in conjunction with a satellite navigation system. The method comprises storing a set of bit patterns corresponding to secondary codes used by the satellite navigation system, and in response to a received request from a receiver to access the set of stored bit patterns, supplying the stored bit patterns to the receiver for use in acquiring signals from the satellite navigation system. The bit patterns may be supplied over the telephone network, the Internet, or any other suitable network.
[0033] Another embodiment of the invention provides a satellite incorporating one or more bit patterns from a final set of bit patterns created using a method such as described above. One or more such bit patterns can also be incorporated into a pseudolite. (A pseudolite generates an analogous positioning signal to that from a navigation satellite, but a pseudolite is ground-based, and is typically employed at locations where high accuracy is required, for example around airports, to augment positioning signals from satellites).
[0034] The approach described herein allows a decision on the final form of the secondary spreading codes to be delayed until a very late stage of system development, since the hardware (e.g. a memory device) need not be specific to a given code (unlike a particular LFSR). Furthermore, it may be possible to update the bit patterns stored in a satellite already in orbit. Such updating may be performed in response to a detected error in the stored bit pattern (perhaps induced by a cosmic ray), as well as being useful for in-orbit testing of codes during the last phase of implementation or commissioning. The update facility is also beneficial if it becomes desirable to transmit a different code from that originally planned, for example because of interference with other services, or because certain slots have been re-allocated. In such circumstances it will generally be required to perform a corresponding update to the receivers, although another reason for updating may be to restrict the set of users that can access the spreading code from the satellite (either for commercial or security reasons).
[0035] Note that although the approach described herein is primarily intended for use in satellite navigation systems (including pseudolites), it could also be employed in other navigation or communication systems (satellite, terrestrial or maritime) that have previously used LFSRs to generate synchronisation codes and such-like.
Brief Description of the Drawings
[0036] Various embodiments of the invention will now be described in detail by way of example only with reference to the following drawings:
Figure 1A illustrates simulated cross-correlation function (CCF) performance between the first two tiered spreading codes sharing a common secondary code for the originally proposed Galileo E5A-Q pilot signals;
Figure 1B illustrates simulated cross-correlation function performance between the first two tiered spreading codes sharing a common secondary code for the originally proposed Galileo E5B-Q pilot signals;
Figure 2 illustrates simulated cross-correlation function (CCF) performance between the first two tiered spreading codes sharing a common secondary code for the Galileo E5A-Q pilot signals with a 10Hz Doppler frequency offset;
Figure 3A illustrates simulated cross-correlation function (CCF) performance using different secondary codes for the Galileo E5A-Q pilot signals in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 3B illustrates simulated cross-correlation function (CCF) performance using different secondary codes for the Galileo E5B-Q pilot signals in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 3C illustrates simulated cross-correlation function (CCF) performance using different secondary codes for the Galileo E5A-Q pilot signals in accordance with one embodiment of the invention, with the inclusion of a 10Hz Doppler frequency offset;
Figure 4 is a high-level flowchart illustrating a method for generating secondary spreading codes in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 5 is a flowchart illustrating part of the method of Figure 4 in more detail in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 6A is a plot of CCF performance for a 50 member group of secondary codes for zero Doppler shift generated in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 6B is a plot of CCF performance for the same 50 member group of secondary codes generated in accordance with one embodiment of the invention as shown in Figure 6A, but averaged across a range of Doppler shifts;
Figure 7 is a high-level schematic diagram of a subsystem for generating a tiered code in accordance with one embodiment of the invention;
Figure 8A is a high-level schematic diagram of a satellite system in accordance with one embodiment of the invention; and
Figure 8B is a high-level schematic diagram of a receiver system in accordance with one embodiment of the invention.
Detailed Description
[0037] The following abbreviations are used in the present description:
ACF
Auto Correlation Function
BPSK
Binary Phase Shift Keying
CCF
Cross Correlation Function
CRC
Cyclic Redundancy Code
CS
Commercial Service
CT
Crosstalk
DC
Direct Current (zero frequency component)
ECC
Error Correcting Code
ELW
Excess Line Weight
HNV
Highest Neighbour Value
LFSR
Linear Feedback Shift Register
MEWSD
Mean Excess Welch Square Distance
MP
Multipath
NV
Neighbour Value
PROM
Programmable Read Only Memory
PSK
Phase Shift Keying
RMS
Root Mean Square
ROM
Read Only Memory
[0038] Note also that within this description code sequences are defined for convenience in logic level format (0 and 1); in practice these code sequences are translated to bipolar (±1) signal levels for modulation and correlation purposes. The mapping between the spreading code logic levels and corresponding signal levels in accordance with one embodiment of the invention is shown in Table 1.
Table 1: Mapping Between Code Logic & Signal Levels
Logic Level Signal Level
1 -1.0
0 1.0
[0039] Table 2 summarises the proposed main ranging code parameters for each Galileo signal component for various services (OS= open service, CS= closed service, SoL= safety of life service). This table excludes the public regulated service (PRS) spreading codes that use cryptographically generated pseudo-random sequences.
Table 2: Galileo Spreading Code Summary
Signal Service(s) Signal Type Symbol Rate (per second) Code Length (ms) Chip Rate (Mcps) Code Length (chips)
Primary Secondary
E5A-I OS Data 50 20 10.23 10230 20
E5A-Q OS Pilot N/A 100 10.23 10230 100
E5B-I OS/CS/So
L Data 250 4 10.23 10230 4
E5B-Q OS/CS/So
L Pilot N/A 100 10.23 10230 100
E6-B CS Data 1000 1 5.115 5115 -
E6-C CS Pilot N/A 100 5.115 5115
(10230) 100
(50)
L1-B OS/CS/So
L Data 250 4 1.023 4092 -
L1-C OS/CS/So
L Pilot N/A 100 1.023 4092 25
[0040] The proposed Galileo spreading code sequence lengths and construction method take into account various signal parameters and performance-related requirements. For all the signal codes shown above the overall sequence lengths have been chosen to be equal to one symbol period for the data signals or 100ms for the pilot signals. For compatibility reasons with GPS, the chipping rates are all multiples of 1.023MHz. As can be seen most of the codes use a tiered approach whereby a primary code is repeated in order to achieve the required overall code sequence length, which is equal to the product of the primary and secondary code lengths. The tiered code approach simplifies the generation of long spreading codes and allows a receiver to acquire the signals just using the primary code sequences, if required, in order to minimise acquisition times.
[0041] Note that a shorter primary code length of 5115 has now been adopted for the commercial service (CS) pilot code on E6 to match that of the corresponding data spreading code, which would be beneficial where both the data and pilot signals are combined for acquisition purposes. As a result, the 50 bit secondary code length as previously proposed would be increased to 100 bits. Therefore, the families of 50 bit secondary codes described later may no longer be needed for the currently proposed Galileo signal on E6-C, which could instead make use of the same 100 bit codes as developed for the E5 pilot signals (and as described in more detail below).
[0042] Each Galileo satellite uses an independent primary code for each signal component in order to provide basic CDMA operation. The primary codes proposed for the E5 signals are based on a family of Gold codes that are generated from the product of a pair of LFSRs (Linear Feedback Shift Registers), while the codes currently proposed for E6-B&C and L1-B&C use a family of primary codes based on the active optimisation of random codes, as described in PCT application PCT/EP2004/014488.
[0043] Table 3 lists the secondary codes previously proposed for the Galileo system, in which the secondary code indicated would be used as a common secondary code for all the corresponding primary code family members. (Note that only certain of the codes have been allocated to particular Galileo signals, as indicated in Table 3; in addition, Table 3 does not reflect the change of the E6-C signal secondary code from 50 bits to 100 bits).
Table 3: Original Galileo Baseline Secondary Code Summary
Code Identifier Code Length (chips) Signal Code Sequence (Octal)
CS4a 4 E5B-I 16
CS20a 20 - 0 146 537
CS20b 20 E5A-I 2 041 351
CS25a 25 L1-C 34012662
CS50a 50 E6-C 31 353 022 416 630 457
CS50b 50 - 30 700 356 335 526 664
CS100a 100 - 1 325 627 352 355 616 455 613 377 214 003 321
CS100b 100 E5A-Q 1 736 526 276 160 463 054 356 046 605 322 257
CS100c 100 - 0 163 523 007 752 215 002 507 555 473 370 713
CS100d 100 E5B-Q 1 017 667 551 661 733 412 501 077 343 115 434
[0044] Figure 1A illustrates the simulated cross-correlation function (CCF) performance between the first two tiered spreading codes for the E5 pilot signals, assuming that the E5A-Q signal codes all share the same 100 chip CS100b secondary code. The primary codes are all 10230 chips in length so the overall tiered code length is 1023000 chips (100ms). Figure 1B shows similar CCF results for the first two E5B-Q pilot signal codes, which share the same CS100d secondary code. No Doppler offset has been included in these simulations (i.e. the plots have been calculated for zero Doppler frequency offset between the two received spreading codes).
[0045] As can be seen the CCF performance is generally very good (Pr at operation 540, then code performance has been improved by the bit change at operation 525. In this case that the test of operation 540 is necessarily positive, leading to a code replacement at operation 545 (since the random test number cannot be greater than unity). However, even if PnN). Each optimisation cycle could then involve retaining the best subset of (say) N code patterns, and then generating another P-N new code patterns for testing in conjunction with the retained subset from the previous cycle. Some optimisation strategies may combine this selection from a larger population with updating individual code patterns within the population (as per operation 525).
[0093] In assessing the codes groups identified in Tables 8 and 9, it will be appreciated that the two main criteria for code design are performance under acquisition and tracking modes of operation. Within these two modes one can distinguish two further performance aspects, namely the suppression of delayed versions of the same code (multipath case), and the rejection of all other satellite codes (crosstalk case). Any performance assessment should include the effects of Doppler frequency shift, as appropriate. One or more additional criteria relating to the code's spectral properties may also be adopted.
[0094] For acquisition, the codes' ACFs (multipath case) or mutual CCFs (crosstalk case), with allowance for Doppler offset, may be-used as performance criteria. These can then be compared to the appropriate Welch bound (WB) for the code length and code family size. These criteria measure the Average Mean Excess Welch Square Distance (AMEWSD) for the multipath and crosstalk cases. For the-multipath case, only a limited range of Doppler shifts are normally tested, since only one satellite code is considered, and this represents the expected range of acquisition search frequency bin error. However in the crosstalk case, which includes other satellite codes, a maximum value of 6.7kHz Doppler shift has to be taken into account. Note that both these criteria take into account the effects of even and odd correlation.
[0095] For tracking purposes, the codes' ACFs (multipath case) or mutual CCFs (crosstalk case) may be used directly to provide an Average Merit Factor (AMF) measure of performance. As for the acquisition tests, the multipath case may be restricted to a limited range of Doppler frequency shifts. In addition, the ACF is only evaluated for time offsets of ±1 and ±2 chips, to reflect the limited range of multipath delays expected while tracking a signal. This range of time offsets is not strictly relevant for the slow secondary codes on their own.
[0096] It is also desirable for the codes to have a flat spectrum, similar to random noise. The presence of strong spectral lines increases cross-talk between codes, as well as susceptibility to external narrowband interference. The criteria used here measure the Average Excess Line Weight (AELW) with respect to the equivalent spectral power for a random code.
[0097] A code evaluation tool based on the five test criteria mentioned above was used to test the secondary code proposals from Tables 8 and 9. The tool performs two types of calculation, namely multipath (MP) and crosstalk (CT), involving one code and a code pair respectively. In theory for testing the secondary codes, the evaluation tool should be run with the complete sets of tiered codes. However this is not feasible with currently available computational resources, and so the secondary codes were tested on their own. This approach is reasonable since the CCF performance of a tiered code can be seen to be the product of the individual primary and secondary codes, and it also avoids the need to specify the primary codes themselves or the assignment of a particular primary code to a particular secondary code, which may both be subject to change.
[0098] Table 10 summarises the results for the 12 different 50 bit secondary code groups G1 to G12 from Table 8, which each contains 50 code members.
Table 10: 50 Bit Secondary Code Group Evaluation Results
Code Group Type MEWSD MF ELW Rank
CT MP CT MP
G1 CS50a 0.6933 0.6933 1.3803 - 2.9595 12
G2 Top 50 0.1346 0.6789 1.0069 - 4.9600 9
G3 0.1340 0.6783 1.0079 - 4.2627 8
G4 0.1336 0.6851 1.0051 - 1.8422 6
G5 0.1287 0.6803 1.0009 - 1.5997 1
G6 0.1337 0.6813 1.0061 - 1.1732 =3
G7 0.1342 0.6830 1.0063 - 1.8302 7
G8 0.1329 0.6846 1.0033 - 1.0411 2
G9 0.1380 0.6807 1.0147 - 1.8349 10
G10 0
Traduzione - Italiano Titolo: CODICI DI DIVISIONE PER UN SISTEMA DI NAVIGAZIONE SATELLITARE
Descrizione
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce alla generazione e all’utilizzo di codici di divisione per un sistema di navigazione satellitare.
Sfondo dell’invenzione
I sistemi di navigazione satellitare stanno diventando sempre più importanti in una vasta gamma di applicazioni, inclusi i dispositivi palmari per la determinazione della posizione, per il supporto alla navigazione a bordo di un’auto, e così via. Il principale sistema di navigazione satellitare in servizio al momento è il sistema di posizionamento globale via satellite (GPS) azionato dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti. Le vendite mondiali di apparecchiature GPS hanno raggiunto quasi i 3,5 miliardi di dollari fino al 2003, e ci si aspetta che questo dato cresca stabilmente nell’arco dei prossimi pochi anni. Un sistema di navigazione satellitare Europeo di controparte, chiamato Galileo, è previsto per il lancio e la disponibilità di servizio nei prossimi dieci anni.
Un sistema di navigazione satellitare comprende una costellazione di satelliti che trasmettono broadcast ciascuno uno o più segnali alla terra. I componenti di base di un segnale satellitare sono costituiti da un codice di divisione (indicato anche come un codice di posizionamento, di sincronizzazione o di misura) che è combinato con i dati di navigazione. La combinazione risultante in seguito è modulata su una portante a una frequenza impostata per la trasmissione alla terra. Ciascun satellite trasmette generalmente a frequenze multiple, il che può essere di aiuto per compensare qualsiasi distorsione atmosferica.
In alcuni casi, segnali multipli (indicati come canali) possono essere modulati su una singola portante mediante qualche schema di multiplazione appropriato. Per esempio, è previsto che determinati segnali di Galileo comprendano un canale di dati in quadratura di fase con un canale pilota. Il canale pilota contiene soltanto un codice di divisione, ma non dati di navigazione, mentre il canale dei dati contiene entrambi il codice di divisione e i dati di navigazione.
La componente del codice di divisione di un segnale satellitare comprende tipicamente una sequenza prefissata di bit ( talvolta indicata come ‘chip’) ed è utilizzata per eseguire due compiti principali. Innanzitutto, il codice di divisione fornisce un meccanismo di sincronizzazione per permettere a un ricevitore di agganciare un segnale satellitare. Pertanto ciascun satellite (e tipicamente ciascun canale trasmesso broadcast da quel satellite) ha il suo proprio codice di divisione. Quando un ricevitore viene acceso inizialmente, non sa quali segnali satellitari possono essere ricevuti, in quanto determinati satelliti nella costellazione saranno al di sotto dell’orizzonte per quella particolare posizione in quel particolare orario. Il ricevitore utilizza i codici di sincronizzazione per agganciare un segnale da un primo satellite. Una volta che questo è stato fatto, è possibile accedere ai dati di navigazione nel segnale. Successivamente questo fornisce i dati delle effemeridi per gli altri satelliti nella costellazione, e permette ai satelliti restanti che sono visibili al ricevitore di essere acquisiti in modo relativamente rapido.
Molti ricevitori impiegano un processo di acquisizione a due fasi. Nella prima fase, il ricevitore esegue una correlazione incrociata simultanea del segnale in arrivo relativamente all’insieme di tutti i segnali possibili. Questo cerca un segnale da qualsiasi satellite, con qualsiasi possibile sfasamento temporale tra il satellite e il ricevitore, e con qualsiasi spostamento Doppler possibile tra il satellite e il ricevitore (che è dipendente dallo spostamento del satellite nello spazio). Se risulta che una correlazione incrociata superi una soglia prefissata, allora è eseguita una seconda fase che implica un’analisi più dettagliata per la combinazione pertinente di satellite, sfasamento temporale, e spostamento Doppler. Questa analisi della seconda fase può comportare, per esempio, un tempo di integrazione più lungo, un tentativo di accedere e di decodificare i dati di navigazione, eccetera, al fine di confermare che è stata fatta un’acquisizione corretta.
Il secondo compito principale di un codice di divisione è di fornire una stima della distanza dal satellite al ricevitore, in base al tempo che il segnale ha impiegato a viaggiare dal satellite al ricevitore, che può essere espresso come: c(Tr-Ts), in cui:
c è la velocità della luce (nota, soggetta agli effetti della ionosfera, eccetera)
Ts è il tempo di invio dal satellite, che è codificato nel segnale stesso, e
Tr è il tempo di ricezione del segnale al ricevitore.
Successivamente la posizione del ricevitore può essere determinata nello spazio tridimensionale utilizzando un processo di triangolazione, date le posizioni note dei satelliti (come specificate nei loro dati di navigazione). In teoria, questo può essere realizzato con le informazioni del segnale da un minimo di tre satelliti. Concretamente tuttavia possiamo scrivere Tr = Tm o, in cui Tm è il tempo misurato di ricezione al ricevitore, e o è lo sfasamento tra l’orologio del ricevitore e l’orologio del satellite, che è generalmente sconosciuto, eccetto che per i ricevitori specializzati. Questo implica allora che le informazioni del segnale siano ottenute da almeno un satellite aggiuntivo per compensare lo sfasamento temporale incognito al ricevitore. Se sono disponibili i segnali da altri satelliti, è possibile effettuare una determinazione statistica della posizione utilizzando qualsiasi algoritmo appropriato come i minimi quadrati. Ciò può anche fornire qualche indicazione sull’errore associato a una posizione stimata.
Un parametro importante per il codice di divisione è la velocità di trasmissione di bit con cui il codice di divisione è trasmesso, in quanto questo a sua volta controlla l’accuratezza con cui è possibile fare la determinazione della posizione. Per esempio, con una velocità di trasmissione di bit di 1MHz, ciascun bit rappresenta un tempo di viaggio della luce di 300 metri. L’accuratezza del posizionamento è pertanto determinata da quanto accuratamente è possibile giudicare lo sfasamento di fase tra il satellite e il ricevitore per un singolo bit. Questo dipende generalmente dal rumore nel sistema. Per esempio, se lo sfasamento di fase può essere misurato fino a un’accuratezza di 90 gradi (/2), questo corrisponde a una determinazione della posizione di 75 metri. Si apprezzerà che avere una velocità di trasmissione di bit superiore per il codice di divisione permette che siano fatte determinazioni della posizione più accurate.
Un altro parametro importante per il codice di divisione è la sua lunghezza totale, in altri termini il numero di bit o di chip nel codice di divisione prima che si ripeta. Una ragione di ciò è che la lunghezza finita del codice di divisione può portare a un’ambiguità nella determinazione della posizione. Per esempio, ipotizziamo che la velocità di trasmissione di bit sia di 10 MHz e che la lunghezza totale della sequenza di bit sia di 256 bit, che pertanto corrisponde a un tempo di viaggio della luce di 7,68 km. Di conseguenza, la misurazione della distanza dal satellite al ricevitore non è specificata in modo univoco, ma piuttosto può essere espressa soltanto come 7,68n d km, in cui d è determinato dalla durata relativa del codice di divisione come trasmesso broadcast e come ricevuto, ma n è un intero incognito. Ci sono vari modi in cui è possibile risolvere l’ambiguità relativamente al valore di n, incluso utilizzare i segnali da un numero maggiore di satelliti, o utilizzando la conoscenza di una posizione approssimata derivata da qualche altra sorgente. Un approccio comune è di correlare la fase del codice al bordo del bit del bit dei dati di navigazione (questo processo è chiamato sincronizzazione di bit), e anche di correlare il bordo del bit al numero di secondi trascorsi dall’inizio della settimana (Time of Week, ToW) contenuto nei dati di navigazione trasmessi dal satellite.
Si apprezzerà che aumentare la lunghezza di ripetizione per il codice di divisione aiuta a ridurre i problemi con le determinazioni della distanza ambigue. Una lunghezza superiore per il codice di divisione fornisce anche una separazione migliore dei segnali da sorgenti differenti, e una accresciuta robustezza contro l’interferenza. D’altra parte, avere una lunghezza di ripetizione più lunga per il codice di divisione può ritardare l’acquisizione iniziale del segnale, così come richiedere una maggiore capacità di elaborazione all’interno del ricevitore. La lunghezza del codice di divisione incide anche sulla velocità dei dati che può essere utilizzata per i dati di navigazione, poiché vi è normalmente soltanto un bit di dati di navigazione per ciascuna sequenza di codice di divisione completa (altrimenti i due potrebbero interferire). Ne consegue che più lunga è la lunghezza di ripetizione del codice di divisione, più bassa è la velocità di trasmissione dei bit per i dati di navigazione.
Una strategia nota per contrastare questo problema consiste nell’utilizzare un codice di divisione gerarchico o a strati basato su codici primario e secondario. Se ipotizziamo che il codice primario abbia N1 bit e che il codice secondario abbia N2 bit, allora i primi N1 bit del codice di divisione complessivo corrispondono alla sequenza primaria cui è assegnato l’OR esclusivo con il primo bit del codice secondario, i successivi N1 bit del codice di divisione comprendono una ripetizione degli N1 bit del codice primario, questa volta con un OR esclusivo con il secondo bit del codice secondario, e così via. Questo fornisce una lunghezza di ripetizione totale per il codice di N1N2. Tuttavia, la lunghezza di ripetizione per gli scopi di sincronizzazione è soltanto N1, in quanto il codice primario darà ancora un picco di correlazione indipendente dal valore del bit dal codice secondario (questo cambierà soltanto il segno del picco di correlazione). Analogamente, la velocità di trasmissione di bit dei dati di navigazione dipende dalla lunghezza del codice primario soltanto (N1), invece che dalla lunghezza dei codici primario e secondario combinati (N1*N2).
I codici di divisione del GPS sono implementati utilizzando i registri a scorrimento di retroazione lineare (Linear Feedback Shift Register, LFSR), in cui dati inviati in uscita selezionati da un registro a scorrimento a N stadi sono controllati e inviati di nuovo all’ingresso. I collegamenti di retroazione all’interno del LFSR possono essere rappresentati come un polinomio di ordine N, attraverso il quale il funzionamento di un LFSR può essere specificato completamente dal suo sviluppo polinomiale e dall’impostazione iniziale del LSFR.
Il GPS utilizza un sottoinsieme di LFSR noto come codici di Gold che hanno determinate proprietà matematiche particolari. Una di queste consiste nel fatto che essi generano un’uscita di rumore pseudo-casuale avente una lunghezza di ripetizione massima di 2N-1, così che un LFSR relativamente compatto può generare un’uscita con una lunghezza di ripetizione lunga. I codici di Gold hanno anche buone proprietà di autocorrelazione che supportano il posizionamento accurato. In particolare, la funzione di autocorrelazione ha un picco ben definito a sfasamento temporale nullo, ed è relativamente piccola per tutti gli altri sfasamenti temporali (vale a dire diversi da zero). È anche possibile selezionare un insieme di codici di Gold che hanno proprietà di correlazione incrociata buone, mediante cui la funzione di correlazione incrociata tra codici differenti è mantenuta relativamente piccola. Questo è importante per l’acquisizione del segnale, in quanto aiuta a evitare che un codice di sincronizzazione da un satellite venga scambiato accidentalmente per un codice di sincronizzazione da un altro satellite. Un altro criterio pratico importante per un codice di divisione è avere numeri uguali (o quasi uguali) di uno e di zeri – questo è noto come bilanciamento.
È possibile trovare informazioni aggiuntive relative ai sistemi di navigazione satellitare, e in particolare relative al GPS in “ Re-Tooling the Global Positioning System” di Per Enge, pagine 64-71, Scientific American, maggio 2004, e in “Global Positioning System: Signals, Measurements and Performance”, di Misra e Enge, Ganga-Jamuna Press, 2001, ISBN 0-9709544-0-9. È possibile trovare informazioni relative ai segnali proposti per Galileo in: “Status of Galileo Frequency and Signal Design” di Hein et al., settembre 2002, disponibile su: http://europa.eu.int/comm/dgs/energy_transport/galileo/doc/galileo_stf_ion2002.pdf, vedere anche “Galileo Frequency and Signal Design” di Issler et al., GPS World, giugno 2003, disponibile su: http://www.gpsworld.com/gpsworld/article/articleDetail.jsp?_id=61244. Un ricevitore proposto per Galileo/GPS è descritto in: "HIGAPS - A Large-Scale Integrated Combined Galileo/GPS Chipset for the Consumer Market" di Heinrichs et al, disponibile su http://forschung.unibw-muenchen.de/papers/krc5ejjfluurjj9jsrxk4spthvmg0be.pdf.
Sebbene l’utilizzo dei codici di Gold sia ben consolidato per i sistemi di navigazione satellitare esistenti, vi sono alcune limitazioni associate a tali codici. Per esempio, essi sono disponibili soltanto con determinate lunghezze di codice (non tutti i valori di N possono essere utilizzati per lo sviluppo polinomiale del LFSR). In generale, la lunghezza del codice è determinata dal rapporto tra la frequenza di chip del codice di divisione e la velocità di trasmissione di bit dei dati di navigazione. Se la lunghezza del codice è limitata a un codice di Gold disponibile, allora questo implica un vincolo sulla frequenza di chip e sulla velocità di trasferimento di bit, che potrebbe a sua volta ripercuotersi su altre considerazioni, come il tempo di acquisizione e l’accuratezza del posizionamento. In alcuni casi, la limitazione sulla lunghezza di codice per i codici di Gold è stata superata utilizzando codici di Gold troncati, ma questo troncamento ha un effetto negativo sulle proprietà matematiche dell’insieme del codice (in termini della funzione di autocorrelazione, eccetera).
Inoltre, le proprietà di correlazione incrociata dei codici di Gold generalmente non sono ottimizzate per la situazione in cui la polarità del codice cambia da una ripetizione del codice alla successiva, in accordo con i dati di navigazione che sono trasmessi. Quest’ultimo problema è esacerbato dove la velocità di trasmissione di bit dei dati di navigazione è relativamente elevata (come per Galileo), in quanto questo porta a una probabilità significativa che una trasmissione di un codice di divisione abbia la polarità opposta relativamente alla trasmissione del codice di divisione immediatamente precedente. (Questa è anche la ragione della fornitura dei canali pilota in Galileo, al fine di aiutare l’acquisizione senza interruzione dai dati di navigazione).
Le proprietà di correlazione incrociata sono anche di particolare rilevanza per le posizioni aventi una ricezione del segnale relativamente scarsa, come all’interno di un edificio. In questo caso un primo segnale da un satellite può essere forte, per esempio, se vi è una linea dello sguardo al satellite attraverso una finestra, mentre un secondo segnale da un altro satellite può essere sostanzialmente più debole, per esempio, se la linea dello sguardo al secondo satellite passa attraverso una struttura dell’edificio imponente. In questa situazione, se viene fatto un tentativo di acquisire il secondo satellite, vi è un rischio che la correlazione relativamente al primo segnale più forte ma non corretto possa portare a un risultato maggiore (o simile) rispetto alla correlazione relativamente al secondo segnale più debole ma corretto. Sebbene qualsiasi risultante identificazione erronea del primo segnale come il secondo segnale normalmente sarà corretta in seguito in una fase di acquisizione successiva, questo introduce ritardi, in quanto successivamente la procedura di acquisizione deve ritornare alla prima fase. Se vi sono molteplici di tali identificazioni erronee, il tempo di acquisizione può aumentare in modo significativo.
Riepilogo dell’invenzione
Di conseguenza, una forma di realizzazione dell’invenzione fornisce un metodo per creare un insieme di codici di divisione secondari per l’utilizzo in un sistema di navigazione satellitare comprendente una costellazione di satelliti. Ciascun satellite nella costellazione impiega un codice di divisione a strati comprendente almeno un codice primario e un codice secondario. A ciascun satellite nella costellazione è assegnato un codice di divisione secondario differente dall’insieme di codici di divisione secondari. Il metodo comprende generare un insieme iniziale di configurazioni binarie, in cui ciascuna configurazione binaria rappresenta un potenziale codice di divisione secondario. Il metodo comprende inoltre eseguire un processo di ottimizzazione sulle configurazioni binarie all’interno dell’insieme iniziale di configurazioni binarie in modo tale che almeno alcune delle configurazioni binarie nell’insieme iniziale siano modificate o sostituite, creando in tal modo un insieme finale di configurazioni binarie per l’utilizzo come insieme di codici di divisione secondari. Il processo di ottimizzazione utilizza una funzione di prestazione o di costo derivata da almeno una tra: (a) la funzione di autocorrelazione per una configurazione binaria, e/o (b) la funzione di correlazione incrociata tra configurazioni binarie differenti.
È stato scoperto che la fornitura di codici di divisione secondari differenti per satelliti differenti riduce la correlazione tra i codici dai satelliti differenti, e così contribuisce con una prestazione migliorata del ricevitore. L’utilizzo di un processo di ottimizzazione per determinare l’insieme di codici secondari offre più flessibilità degli insiemi di codici basati sugli algoritmi matematici (come i codici di Gold), per esempio in termini della lunghezza del codice secondario, il numero di codici disponibili in un insieme, e le proprietà particolari dei codici.
In una forma di realizzazione, le configurazioni binarie nell’insieme iniziale di configurazioni binarie comprendono sequenze casuali di bit, sebbene possa essere utilizzata qualsiasi altra configurazione iniziale adeguata, per esempio come quella generata dai registri a scorrimento di retroazione lineare o da qualche altro algoritmo pseudo casuale. Si noti che l’utilizzo di configurazioni binarie iniziali create in modo casuale generalmente contribuisce ad assicurare una buona copertura dello spazio di ricerca complessivo per i potenziali codici secondari. Durante il processo di ottimizzazione, le configurazioni binarie possono essere modificate ribaltando in modo casuale un bit in almeno una delle configurazioni binarie. Per codici secondari più lunghi può essere auspicabile ribaltare bit multipli durante almeno la parte iniziale del processo di ottimizzazione al fine di velocizzare la convergenza, sebbene dato che i codici secondari sono usualmente relativamente brevi (in confronto alla lunghezza complessiva di un codice a strati), è stato scoperto che ribaltare soltanto un bit singolo del codice per ciascuna iterazione generalmente fornisce una velocità di convergenza ragionevole. Le modifiche di bit possono essere invertite se risulta che portino a una prestazione ridotta (pertanto assicurando che l’insieme di configurazioni binarie non venga deteriorato), sebbene tali prestazione ridotte possano essere accettate su una base probabilistica (specialmente se la diminuzione non è troppo grande) al fine di dare all’ottimizzazione la capacità di deviare dai massimi locali.
Si apprezzerà che vi è una grande varietà di strategie di ottimizzazione note, come la tempratura simulata, gli algoritmi genetici, e così via, e qualsiasi siffatta strategia adeguata può essere impiegata per creare l’insieme finale di configurazioni binarie. In alcune di queste strategie, l’ottimizzazione può comportare la generazione di una popolazione più ampia di configurazioni binarie seguita dalla selezione degli esempi migliori (ad esempio la legge del più forte), mentre altre strategie possono essere basate sulla modifica continua delle configurazioni binarie individuali all’interno di un insieme predeterminato.
In una forma di realizzazione, il processo di ottimizzazione include rifiutare le configurazioni binarie che non soddisfano un criterio di bilanciamento, assicurando in tal modo che nel codice vi sia una componente DC relativamente piccola. Il criterio di bilanciamento può essere basato sulla radice quadrata del numero di bit in una configurazione binaria, che riflette la componente DC aspettata per un codice casuale. Si noti che in altre forme di realizzazione, il bilanciamento del codice potrebbe essere incluso come parte dell’ottimizzazione formale – vale a dire l’ottimizzazione lavora per ridurre il bilanciamento, invece di rifiutare semplicemente le configurazioni binarie con un bilanciamento che è superiore a una data soglia. Un’altra possibilità consiste nel fatto che una volta che sono state identificate le configurazioni binarie aventi buone proprietà di bilanciamento, allora il processo di ottimizzazione è disposto per lasciare il bilanciamento invariante (per esempio selezionando coppie di bit da ribaltare, uno essendo uno 0 e uno essendo un 1). Altri criteri di codice che potrebbero essere gestiti in una maniera simile al bilanciamento includono la lunghezza di corsa massima del valore di un bit specifico (uno e/o zero).
Il processo di ottimizzazione può utilizzare una funzione di prestazione (o di costo) derivata dalla funzione di autocorrelazione per una configurazione binaria per selezionare le configurazioni binarie che abbiano buone proprietà individuali. Una funzione di prestazione o di costo derivata dalla funzione di correlazione incrociata può essere utilizzata successivamente per selezionare un gruppo di configurazioni binarie che in combinazione formano un buon insieme di codici. Si apprezzerà che lobi laterali minimi nella funzione di autocorrelazione portano a proprietà di acquisizione migliori, per esempio, il segnale può essere acquisito più facilmente in condizioni di ricezione scarse, come all’interno e al di sotto della chioma di un albero, mentre una correlazione incrociata minima con gli altri codici riduce l’interferenza di accesso multiplo e il rumore intra sistema, aumentando pertanto la robustezza dell’acquisizione del segnale, dell’inseguimento e della demodulazione dei dati.
Il processo di ottimizzazione può includere una prima fase di identificare le configurazioni binarie aventi buone proprietà individuali, e una seconda fase di selezionare l’insieme di codici di divisione secondari dalle configurazioni binarie identificate aventi buone proprietà individuali. Il numero di configurazioni binarie identificate come quelle aventi buone proprietà individuali può essere significativamente superiore al numero di satelliti nella costellazione. Per esempio, la prima fase può identificare un gruppo di 250 o più configurazioni binarie che hanno buone proprietà individuali. In seguito un tale gruppo fornisce una buona gamma di scelta durante la seconda fase dell’ottimizzazione, così come utilizzi potenziali accomodanti dei codici al di fuori della costellazione di satelliti stessa – per esempio negli pseudoliti, come discusso in maggior dettaglio di seguito, che possono comportare una richiesta di un numero maggiore di codici potenziali.
Si è scoperto che l’utilizzo della prima e della seconda fase per l’ottimizzazione sia un approccio conveniente ed efficace per eseguire l’ottimizzazione. Tuttavia, altre forme di realizzazione potrebbero utilizzare un’unica fase di ottimizzazione che è eseguita direttamente su gruppi di configurazioni binarie.
In una forma di realizzazione, la seconda fase include calcolare la funzione di correlazione incrociata tra ogni coppia di configurazioni binarie identificate come quelle aventi buone proprietà individuali. Si è scoperto che questa ricerca esaustiva di tutte le combinazioni possibili è più efficiente dal punto di vista computazionale di una ricerca iterativa dei potenziali insiemi di configurazioni binarie, sebbene possa essere utilizzato l’ultimo approccio se appropriato (per esempio, se il numero di configurazioni binarie identificate è molto grande).
In una forma di realizzazione, il numero di bit in una configurazione binaria per un codice secondario è nella gamma da 25 a 512, più in particolare nella gamma da 50 a 128. Si noti che per lunghezze di codice secondario molto brevi, lo spazio di codice disponibile può essere cercato in modo esaustivo per determinare un insieme adeguato di configurazioni binarie (invece che utilizzare una forma di procedura di ottimizzazione come descritto nella presente).
Un’altra forma di realizzazione dell’invenzione fornisce un ricevitore che incorpora un insieme finale di configurazioni binarie create utilizzando il metodo di cui sopra. Le configurazioni binarie nel ricevitore possono essere protette da un codice di correzione dell’errore. Il ricevitore può avere almeno una memoria di sola lettura (ROM) che memorizza le porzioni di codice secondario dei codici di divisione a strati, e facoltativamente anche le porzioni di codice primario. In alcuni ricevitori, è possibile aggiornare questa ROM, per esempio per riflettere qualsiasi cambiamento ai codici di divisione emessi dai satelliti.
In alcune implementazioni, il ricevitore può incorporare le configurazioni binarie per almeno due costellazioni di satelliti, per esempio Galileo e GPS. Si noti che i codici di divisione del GPS sono codici di Gold, e normalmente sono generati all’interno di un ricevitore utilizzando un registro a scorrimento di retroazione lineare. Tuttavia, i codici del GPS possono essere memorizzati come configurazioni binarie complete se si desidera avere un unico approccio consistente da utilizzare per sistemi di navigazione satellitare multipli.
Si noti che vi sono vari modi in cui le configurazioni binarie possono essere fornite al ricevitore. Per esempio, in alcune forme di realizzazione le configurazioni binarie possono essere pre-installate nel ricevitore. In alcune forme di realizzazione, le configurazioni binarie possono essere installate (o aggiornate) nel ricevitore mediante qualche forma di dispositivo di memoria amovibile, come una memoria flash. In alcune forme di realizzazione, le configurazioni binarie possono essere installate (o aggiornate) nel ricevitore attraverso una rete, per esempio scaricando attraverso Internet o attraverso una rete di telefonia mobile (l’ultima è particolarmente conveniente se il ricevitore stesso è incorporato in qualche forma di dispositivo di telefonia mobile). Con questo ultimo approccio, i codici non devono necessariamente essere memorizzati nel ricevitore stesso, ma piuttosto è possibile accedervi come e quando necessario attraverso la rete.
Di conseguenza un’altra forma di realizzazione dell’invenzione fornisce un metodo di funzionamento di un server che comunica con i ricevitori per l’utilizzo insieme a un sistema di navigazione satellitare. Il metodo comprende memorizzare un insieme di configurazioni binarie corrispondenti ai codici secondari utilizzati dal sistema di navigazione satellitare, e in risposta a una richiesta ricevuta da un ricevitore di accedere all’insieme delle configurazioni binarie memorizzate, fornire le configurazioni binarie memorizzate al ricevitore per l’utilizzo nell’acquisire i segnali dal sistema di navigazione satellitare. Le configurazioni binarie possono essere fornite attraverso la rete telefonica, Internet, o qualsiasi altra rete idonea.
Un’altra forma di realizzazione dell’invenzione fornisce un satellite che incorpora una o più configurazioni binarie da un insieme finale di configurazioni binarie create utilizzando un metodo come quello descritto sopra. Una o più di tali configurazioni binarie può anche essere incorporata in uno pseudolite. (Uno pseudolite genera un segnale di posizionamento analogo a quello da un satellite di navigazione, ma uno pseudolite è al suolo, ed è impiegato tipicamente in posizioni in cui è richiesta una grande accuratezza, per esempio intorno agli aeroporti, per aumentare i segnali di posizionamento dai satelliti).
L’approccio descritto nella presente consente che una decisione sulla forma finale dei codici di divisione secondari sia posticipata fino a uno stadio molto posteriore dello sviluppo del sistema, in quanto l’hardware (ad esempio un dispositivo di memoria) non deve essere specifico per un dato codice (a differenza di un LFSR specifico). Inoltre, è possibile aggiornare le configurazioni binarie memorizzate in un satellite già in orbita. Tale aggiornamento può essere eseguito in risposta a un errore rilevato nella configurazione binaria memorizzata (magari indotto da un raggio cosmico), così come essere utile per la verifica in orbita dei codici durante l’ultima fase di implementazione o di collaudo. La capacità di aggiornamento è vantaggiosa anche se diventa desiderabile trasmettere un codice differente da quello pianificato originariamente, per esempio a causa dell’interferenza con altri servizi, o perché determinate slot sono state riallocate. In tali circostanze generalmente sarà necessario eseguire un corrispondente aggiornamento ai ricevitori, sebbene un’altra ragione per aggiornare possa essere limitare l’insieme di utenti che possono accedere al codice di divisione dal satellite (per ragioni commerciali o di sicurezza).
Si noti che sebbene l’approccio descritto nella presente sia destinato primariamente all’utilizzo nei sistemi di navigazione satellitare (inclusi gli pseudoliti), esso può anche essere impiegato in altri sistemi di navigazione o di comunicazione (satellitare, terreste o marittimo) che precedentemente hanno utilizzato i LFSR per generare i codici di sincronizzazione e affini.
Breve descrizione dei disegni
Varie forme di realizzazione dell’invenzione saranno ora descritte in dettaglio soltanto a titolo di esempio facendo riferimento ai disegni seguenti:
la Figura 1A illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) tra i primi due codici di divisione a strati che condividono un codice secondario comune per i segnali pilota di Galileo E5A-Q proposti originariamente;
la Figura 1B illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) tra i primi due codici di divisione a strati che condividono un codice secondario comune per i segnali pilota di Galileo E5B-Q proposti originariamente;
la Figura 2 illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) tra i primi due codici di divisione a strati che condividono un codice secondario comune per i segnali pilota di Galileo E5A-Q con uno spostamento Doppler in frequenza di 10 Hz;
la Figura 3A illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) utilizzando codici secondari differenti per i segnali pilota di Galileo E5A-Q secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 3B illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) utilizzando codici secondari differenti per i segnali pilota di Galileo E5B-Q secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 3C illustra la prestazione di una funzione di correlazione incrociata simulata (CCF) utilizzando codici secondari differenti per i segnali pilota di Galileo E5A-Q secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, con l’inclusione di uno spostamento Doppler in frequenza di 10 Hz;
la Figura 4 è un diagramma di flusso di alto livello che illustra un metodo per generare codici di divisione secondari secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 5 è un diagramma di flusso che illustra parte del metodo della Figura 4 in maggior dettaglio secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 6A è un grafico della prestazione della CCF per un gruppo di 50 elementi di codici secondari per lo spostamento Doppler nullo generato secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 6B è un grafico della prestazione della CCF per lo stesso gruppo di 50 elementi di codici secondari generati secondo una forma di realizzazione dell’invenzione come illustrato nella Figura 6A, ma mediato attraverso una gamma di spostamenti Doppler;
la Figura 7 è un diagramma schematico di alto livello di un sottosistema per generare un codice a strati secondo una forma di realizzazione dell’invenzione;
la Figura 8A è un diagramma schematico di alto livello di un sistema satellitare secondo una forma di realizzazione dell’invenzione; e
la Figura 8B è un diagramma schematico di alto livello di un sistema ricevitore secondo una forma di realizzazione dell’invenzione.
Descrizione dettagliata
Le abbreviazioni seguenti sono utilizzate nella presente descrizione:
ACF Funzione di Autocorrelazione
BPSK Modulazione Binaria a Spostamento di Fase
CCF Funzione di Correlazione Incrociata
CRC Codice di Ridondanza Ciclica
CS Servizio Commerciale
CT Diafonia
DC Corrente Continua (componente a frequenza zero)
ECC Codice di Correzione dell’Errore
ELW Carico di Linea Eccessivo
HNV Valore Vicino più Alto
LFSR Registro a Scorrimento di Retroazione Lineare
MEWSD Distanza Quadratica Media di Welch in Eccesso
MP Cammini Multipli
NV Valore del Vicino
PROM Memoria Programmabile di Sola Lettura
PSK Modulazione a Spostamento di Fase
RMS Scarto Quadratico Medio
ROM Memoria di Sola Lettura
Si noti anche che in questa descrizione le sequenze di codice sono definite per convenienza nel formato del livello logico (0 e 1); in pratica queste sequenze di codice sono tradotte in livelli di segnale bipolare (± 1) per scopi di modulazione e correlazione. La mappatura tra i livelli logici del codice di divisione e i livelli di segnale corrispondenti secondo una forma di realizzazione dell’invenzione è illustrata nella Tabella 1.
Tabella 1: Mappatura tra la logica del codice e i livelli del segnale
Livello logico Livello del segnale
1 -1,0
0 1,0
La Tabella 2 riepiloga i principali parametri di codice di misura proposti per ciascuna componente del segnale di Galileo per vari servizi (OS = Servizio Aperto, CS = Servizio Chiuso, SoL = Servizio di Salvaguardia della Vita). Questa Tabella include i codici di divisione del servizio pubblico regolamentato (PRS) che utilizzano sequenze pseudo casuali generate in modo crittografico.
Tabella 2: Riepilogo del codice di divisione di Galileo
Segnale Servizio(s) Tipo di segnale Frequenza di Simbolo (al secondo) Lunghezza del codice (ms) Frequenza di chip (Mcps) Lunghezza del codice (chip)
Primario Secondario
E5A-I OS Dati 50 20 10,23 10230 20
E5A-Q OS Pilota N/A 100 10,23 10230 100
E5B-I OS/CS/So
L Dati 250 4 10,23 10230 4
E5B-Q OS/CS/So
L Pilota N/A 100 10,23 10230 100
E6-B CS Dati 1000 1 5,115 5115 -
E6-C CS Pilota N/A 100 5,115 5115
(10230) 100
(50)
L1-B OS/CS/So
L Dati 250 4 1,023 4092 -
L1-C OS/CS/So
L Pilota N/A 100 1,023 4092 25
Le lunghezze e il metodo di realizzazione della sequenza del codice di divisione di Galileo proposto tengono in considerazione vari parametri e requisiti del segnale correlati alla prestazione. Per tutti i codici di segnale illustrati sopra le lunghezze complessive della sequenza sono state scelte in modo tale da essere uguali a al periodo di un simbolo per i segnali dei dati o a 100 ms per i segnali pilota. Per ragioni di compatibilità con il GPS, le frequenze di chip sono tutte multipli di 1,023 MHz. Come è possibile osservare la maggior parte dei codici utilizza un approccio a strati per cui un codice primario è ripetuto al fine di realizzare la lunghezza della sequenza di codice complessiva richiesta, che è uguale al prodotto delle lunghezze del codice primario e secondario. L’approccio del codice a strati semplifica la generazione di codici di divisione lunghi e permette a un ricevitore di acquisire i segnali utilizzando soltanto le sequenze di codice primario, se necessario, al fine di minimizzare i tempi di acquisizione.
Si noti che una lunghezza di codice primario inferiore a 5115 è stata adottata ora per il codice pilota del servizio commerciale (CS) su E6 affinché corrisponda a quella del rispettivo codice di divisione di dati, il che sarebbe vantaggioso dove entrambi i segnali dei dati e pilota siano combinati a scopo di acquisizione. Di conseguenza, la lunghezza del codice secondario di 50 bit come proposto precedentemente aumenterebbe a 100 bit. Pertanto, è possibile che le famiglie di codici secondari di 50 bit descritte in seguito non siano più necessarie per il segnale di Galileo su E6-C attualmente proposto, che potrebbe invece fare uso degli stessi codici di 100 bit come quelli sviluppati per i segnali pilota E5 (e come descritto in maggior dettaglio di seguito).
Ciascun satellite di Galileo utilizza un codice primario indipendente per ciascuna componente del segnale al fine di fornire un funzionamento di Accesso Multiplo a Divisione di Codice (Code Divisione Multiple Access, CDMA) di base. I codici primari proposti per i segnali E5 sono basati su una famiglia di codici di Gold che sono generati dal prodotto di una coppia di LFSR (Registri a Scorrimento di Retroazione Lineare), mentre i codici proposti attualmente per E6-B&C e L1-B&C utilizzano una famiglia di codici primari basati sull’ottimizzazione attiva di codici casuali, come descritto nella domanda di brevetto PCT PCT/EP2004/014488.
La Tabella 3 elenca i codici secondari precedentemente proposti per il sistema Galileo, in cui il codice secondario indicato sarebbe utilizzato come un codice secondario comune per tutti gli elementi della famiglia del codice primario corrispondente. (Si noti che soltanto alcuni dei codici sono stati allocati ai segnali di Galileo particolari, come indicato nella Tabella 3; inoltre, la Tabella 3 non riflette il cambiamento del codice secondario del segnale E6-C da 50 bit a 100 bit).
Tabella 3: Riepilogo del Codice Secondario di Riferimento Originale di Galileo.
Identificatore del codice Lunghezza del codice (chips) Segnale Sequenza del codice (Ottale)
CS4a 4 E5B-I 16
CS20a 20 - 0 146 537
CS20b 20 E5A-I 2 041 351
CS25a 25 L1-C 34012662
CS50a 50 E6-C 31 353 022 416 630 457
CS50b 50 - 30 700 356 335 526 664
CS100a 100 - 1 325 627 352 355 616 455 613 377 214 003 321
CS100b 100 E5A-Q 1 736 526 276 160 463 054 356 046 605 322 257
CS100c 100 - 0 163 523 007 752 215 002 507 555 473 370 713
CS100d 100 E5B-Q 1 017 667 551 661 733 412 501 077 343 115 434
La Figura 1A illustra la prestazione della funzione di correlazione incrociata (CCF) simulata tra i primi due codici di divisione a stati per i segnali pilota E5, ipotizzando che i codici di segnale E5A-Q condividano tutti lo stesso codice secondario di 100 chip CS100b. I codici primari sono tutti di 10230 chip in lunghezza così che la lunghezza complessiva del codice a strati è di 1023000 chip (100 ms). La Figura 1B illustra risultati della CCF simili per i primi due codici del segnale pilota E5B-Q, che condividono lo stesso codice secondario SC100d. In queste simulazioni non è stato incluso alcuno spostamento Doppler (vale a dire i grafici sono stati calcolati per uno spostamento Doppler in frequenza nullo tra i due codici di divisione ricevuti).
Come è possibile osservare la prestazione della CCF è generalmente molto buona (< -50dB) relativamente al picco massimo della ACF. Tuttavia l’utilizzo di un codice secondario comune produce una prestazione della CCF molto più scarsa (~ -30dB) per gli sfasamenti di codice entro lo ± 0,01 la lunghezza della sequenza (= ± 10230 chip ≡ ± 1 ms). Questo corrisponde alla regione in cui i codici secondari sono allineati e la prestazione della CCF è pertanto limitata a quella fornita soltanto dai codici primari. Si noti che concretamente è previsto che gli sfasamenti temporali tra i satelliti rientrino nella gamma di circa ± 20 ms (a causa dei ritardi di propagazione). Pertanto sebbene la gamma completa degli sfasamenti della CCF illustrata nelle Figure 2A e 2B non dovrebbe verificarsi concretamente, questo non esclude le regioni con i picchi alti della CCF.
Un approccio possibile per provare a eliminare i picchi alti della CCF potrebbe essere di sfasare deliberatamente nel tempo il codice secondario comune tra i satelliti differenti. Tuttavia questo richiederebbe spostamenti temporali della sequenza del codice di 40 ms tra i satelliti differenti, e poiché la lunghezza del codice a strati massima è di 100 ms (per i segnali pilota) allora è possibile riutilizzare ciascun codice soltanto due volte. Anche se consentiamo che gli stessi codici siano utilizzati per i satelliti agli antipodi, questo è sufficiente soltanto per un totale di 4 satelliti e non per i 30 inclusi nella costellazione di Galileo.
Un altro approccio possibile sarebbe di aumentare ulteriormente le lunghezze del codice pilota. Tuttavia, questo non è considerato di interesse, a causa dei lunghi tempi di integrazione necessari e dell’impatto corrispondente sulla realizzazione del ricevitore.
Le sequenze lunghe di codice pilota di 100 ms sono sensibili agli spostamenti Doppler. Infatti, uno spostamento Doppler di soltanto 10 Hz introduce un ciclo di spostamento di fase completo in una sequenza rispetto all’altra, provocando in tal modo che metà della sequenza sia invertita. Questo cambia completamente la CCF some è possibile osservare nella Figura 2, che illustra la CCF per i codici pilota E5A-Q utilizzando un codice secondario comune con uno spostamento Doppler in frequenza di 10 Hz. L’effetto dello spostamento Doppler di 10 Hz su questi segnali pilota E5A riduce i livelli delle CCF nel caso peggiore da -30 a -42dB relativamente al livello massimo della ACF corrispondente per un codice singolo. La distribuzione degli spostamenti Doppler in frequenza tra le coppie di satelliti è approssimativamente lineare fino al valore massimo di 6,7 kHz per la costellazione di satelliti Galileo proposta.
La frequenza di chip effettiva dei codici secondari dipende dalle frequenze di ripetizione dei codici primari corrispondenti. Dal momento che i codici secondari considerati nella Figura 2 sono utilizzati per le componenti del segnale pilota da 100 ms, la frequenza di chip effettiva è semplicemente N10 Hz, in cui N è la lunghezza del codice secondario, corrispondente a 500 Hz e a 1000 Hz per codici secondari rispettivamente di 50 bit e 100 bit. Quando lo spostamento Doppler in frequenza è uguale a queste frequenze di chip effettive allora il cambiamento di fase per il chip del codice secondario diventa 2π, dopo di che l’effetto Doppler si ripete. Si noti che questa condizione non vale per i codici primari sottostanti e così non sarà possibile osservare la CCF del codice a strati complessivo ripetersi a questi intervalli di frequenza.
Ne consegue che, per ragioni di inseguimento, la probabilità combinata che altri satelliti abbiano sia uno spostamento Doppler relativo al di sotto di 10 Hz sia un errore di temporizzazione relativo inferiore a 1 ms è abbastanza piccola. Di conseguenza, l’impatto complessivo dei picchi massimi della CCF a -30 dB è ridotto in modo significativo. (Si noti che peri codici secondari di 50 bit più brevi, la regione di errore temporale corrispondente aumenta a 20 ms, ma l’impatto è ancora moderatamente basso).
Tuttavia, durante i modi di acquisizione iniziale, quando deve essere analizzata un’ampia gamma di spostamenti temporali e di frequenza, è probabile che i picchi secondari relativamente alti della CCF derivanti dall’usare i codici secondari comuni provochino rilevamenti falsi indesiderabili. Ciò può ridurre la prestazione in condizioni difficili di acquisizione, come per le applicazioni in interno, in cui è possibile che si verifichino ampie variazioni tra i livelli del segnale del satellite.
La Figura 3A illustra come la prestazione della CCF può essere migliorata utilizzando codici secondari differenti per ciascun codice primario. Nella Figura 3A, il codice a strati per il codice E5A-Q 1è stato modificato per usare il codice secondario CS100a e la CCF è stata ricalcolata. Non è incluso alcuno spostamento Doppler in frequenza. Come è possibile osservare, i lobi laterali del caso peggiore della CCF sono stati ridotti a meno di -42 dB, che è un miglioramento di 12 dB in queste condizioni di spostamento Doppler nullo.
Come conferma, la Figura 3B illustra la CCF per i codici pilota 1 e 2 di E5B-Q in cui il codice secondario per il codice a strati 1 è stato cambiato in CS100c. Nuovamente, i lobi laterali del caso peggiore della CCF sono stati ridotti approssimativamente a -42 dB, che è lo stesso di quanto illustrato precedentemente per i codici pilota E5A quando sono utilizzati codici secondari differenti.
La Figura 3C rappresenta la CCF per i due segnali pilota E5A utilizzando codici secondari differenti, ma questa volta con uno spostamento Doppler in frequenza di 10 Hz. Questo illustra una prestazione della CCF leggermente degradato relativamente alla Figura 3A, con un picco nel caso peggiore di -40 dB.
Al fine di utilizzare codici secondari differenti per satelliti differenti, è necessario trovare gli elementi di codice sufficienti di qualità adeguata per essere utilizzati con il codice primario di ciascun satellite. Per un codice di N bit ci sono un totale di 2N combinazioni di codice possibili, ma soltanto un numero limitato di queste avrà proprietà di codice indipendenti. Per esempio, ciascun codice può essere invertito o rovesciato e avrà ancora proprietà di codice identiche; analogamente ciascuna sequenza di codice può essere ruotata ciclicamente mediante il numero di chip nella lunghezza di codice e avrà ancora proprietà di codice identiche. Ne consegue che, per un codice di N bit il numero massimo di codici indipendenti (CN) è:
CN = 2N/(4.N)
(Si noti che questa formula è approssimata e rappresenta soltanto un limite superiore, in quanto include per esempio codici che sono simmetrici, vale a dire uguali in avanti e all’indietro, e/o che contengono sequenze ripetute, che non è probabile che forniscano codici utili). Tuttavia, la formula di sopra può essere applicata alle lunghezze di codice secondario considerate per i segnali di Galileo per stimare il numero di codici indipendenti disponibili per i codici secondari, come elencato nella Tabella 4.
Tabella 4: Numero di Codici Secondari Indipendenti
Lunghezza del Codice Secondario Numero di Codici Indipendenti
4 1
20 13107
25 335544
50 5,6 x 1012
100 3,2 x 1027
Per i codici secondari più brevi di 25 bit o meno, è fattibile dal punto di vista computazionale con gli attuali mezzi a disposizione eseguire le ricerche esaustive di tutte le possibilità di codice al fine di trovare quelle con proprietà accettabili (o ottime). Tuttavia, per i codici secondari più lunghi di 50 e di 100 bit ci sono troppi codici possibili affinché sia pratico cercare in modo esaustivo utilizzando i mezzi computazionali attualmente a disposizione. Tuttavia, è possibile ottenere una buona prestazione per codici di riferimento di 50 e di 100 bit utilizzando un punto iniziale di codice casuale, e successivamente eseguendo un processo di ottimizzazione in base al chip. Infatti, poiché ci sono più scelte disponibili per i codici più lunghi, in generale questo permette di applicare criteri di ottimizzazione o di selezione più stringenti relativamente a tali codici.
Al fine di trovare le famiglie idonee di codici secondari, è stato adottato un processo di ricerca a due stadi come illustrato nel diagramma di flusso della Figura 4 in accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione. Inizialmente è stato trovato un insieme codici secondari candidati (405), in cui i candidati avevano individualmente buone proprietà di ACF, ELW e di bilanciamento DC (come descritto in maggior dettaglio di seguito). In secondo luogo, dall’insieme di codici candidati trovati, sono stati cancellati i codici candidati che non erano reciprocamente indipendenti (410), ed è stato selezionato un gruppo o una famiglia di codici secondari aventi buone proprietà reciproche della CCF (415) (difatti sono stati scelti svariati gruppi, a seconda dei criteri di selezione differenti).
Uno o più criteri di selezione sono necessari al fine di identificare e selezionare i codici con buone proprietà. I parametri importanti per una tale selezione sono la funzione di autocorrelazione (ACF), il carico di linea eccessivo (ELW) e il bilanciamento di codice. Il criterio de carico di linea eccessivo (ELW) è definito come il rapporto di potenza in dB tra la più alta linea spettrale del codice di divisione rispetto al valore dello scarto quadratico medio complessivo. Un criterio di bilanciamento DC del codice è semplicemente la somma di tutti i chip del codice, ipotizzando che sia utilizzata la notazione del segnale (± 1), e corrisponde alla componente (DC) a frequenza zero dello spettro del codice.
Per la prestazione della ACF, è possibile utilizzare due sotto criteri differenti. Il primo di questi è il valore del vicino più elevato (HNV), che è un’indicazione della differenza di altezza tra il picco della ACF e il picco successivo più grande. In una forma di realizzazione, per i codici pilota che utilizzano codici secondari lunghi, questo criterio è definito come:
HNVp = (N/HNV)2 in cui N = lunghezza del codice in chip.
Il secondo criterio della ACF è un fattore di merito (MF), che è determinato dalla media di tutti i valori vicini della ACF.
MFp = N2 / ∑ NV2 in cui NV sono i valori vicini.
È pertanto possibile definire un criterio di selezione generale come segue:
Prestazione = HNVp MFp/100 – ELW
Sebbene il criterio del bilanciamento del codice non compaia direttamente all’interno di questo parametro di prestazione generale, esso è utilizzato per rifiutare tutti i codici in cui:
|Bilanciamento DC| > √N in cui N = lunghezza del codice in chip.
(Si noti che questa soglia è il valore medio DC da aspettarsi per una sequenza di codice casuale).
Utilizzando questi criteri, la Tabella 5 illustra la prestazione per i codici secondari di 50 e di 100 bit dalla Tabella 3. Si noti che i HNV della ACF corrente sono 6 per i codici di 50 bit e 8 peri codici secondari di 100 bit.
Tabella 5: Prestazione del codice secondario di riferimento di Galileo di 50 & 100 Bit.
Codice Segnale Prestazione HNVp MFp ELW (dB) Bilanciamento DC
Come detto precedentemente il numero di codici possibili per i codici secondari più lunghi di 50 e di 100 bit è troppo grande per le tecniche di ricerca esaustive con i mezzi computazionali attualmente disponibili (sebbene questo possa certamente cambiare in futuro). Pertanto un processo di ottimizzazione, come quello illustrato nel diagramma di flusso della Figura 5, è stato utilizzato per ottenere un insieme finale di codici secondari candidati da una selezione di codice casuale iniziale in accordo con una forma di realizzazione dell’invenzione (questa corrisponde all’operazione 405 dalla Figura 4).
Per avviare il processo viene generato (510) un codice binario di riferimento casuale (Cr) della lunghezza richiesta (N bit). Inizialmente il modulo del valore del bilanciamento DC del codice è testato per controllare se supera la radice quadrata del numero di bit del codice (515). Se questo è il caso allora il codice è rifiutato, e un altro codice casuale è generato al suo posto. Quando viene trovato un codice bilanciato in modo accettabile la sua prestazione è calcolata come un valore di riferimento (Pr) (520). Si noti che il processo di ottimizzazione utilizzato nel metodo della Figura 5 tenta di massimizzate un fattore correlato alla prestazione, sebbene altre forme di realizzazione possano invece tentare di minimizzare qualche sorta di funzione di costo (per gli scopi attuali questi possono essere considerati generalmente come la stessa cosa).
Successivamente uno o più bit del codice di riferimento sono invertiti casualmente per produrre un codice nuovo (Cn) (525). Il numero di bit invertiti controlla la dimensione del “passo” attraverso lo spazio di ricerca. Un approccio è di invertire un numero relativamente ampio di bit inizialmente, corrispondente a passi grandi attraverso lo spazio di ricerca quando presumibilmente l’algoritmo è molto lontano da un massimo, e successivamente di invertire un numero inferiore di bit in iterazioni successive man mano che viene approcciato il massimo, al fine di realizzare una ricerca a grana più fina. Nelle circostanze presenti, è stato trovato generalmente accettabile invertire soltanto un singolo bit ogni volta per l’operazione 525. Questo rappresenta ancora un cambiamento dell’1% nella sequenza (per una sequenza di 100 chip), e pertanto non porta a una convergenza esageratamente lenta.
Viene ora sottoposto a test se il nuovo codice non soddisfa il criterio di bilanciamento DC (530). Se così, il nuovo codice è rifiutato, e ritorniamo all’operazione 525 per generare un codice nuovo ribaltando un bit (o dei bit) casuale(i) del codice Cr (non del codice Cn).
Ipotizzando tuttavia che il codice Cn soddisfi il criterio di bilanciamento DC all’operazione 530, la prestazione del nuovo codice Cn è misurata come Pn (535). Un processo di decisione di ottimizzazione è eseguito in seguito (540) per testare se un numero casuale selezionato linearmente dalla gamma (0 < Casuale < 1) è inferiore all’esponente del delta nel valore della prestazione tra il codice nuovo e il codice di riferimento, vale a dire [exp(Pn- Pr)]. Se il test dell’operazione 540 fornisce il valore di falso, il codice Cn è rifiutato, e ritorniamo all’operazione 525 per generare un codice nuovo ribaltando un bit (o dei bit) casuale(i) del codice Cr (non del codice Cn). In alternativa, se il test dell’operazione 540 fornisce un valore di vero, allora il codice nuovo è adottato come il codice attuale (545), per cui Cr diventa uguale a Cn, e Pr è posto uguale a Pn.
Si noti che se Pn > Pr all’operazione 540, allora la prestazione del codice è stata migliorata dal cambiamento del bit all’operazione 525. In questo caso in cui il test dell’operazione 540 è necessariamente positivo, portando a una sostituzione del codice all’operazione 545 (in quanto il numero di test casuale non può essere superiore all’unità). Tuttavia, anche se Pn < Pr, indicando che la prestazione del codice nuovo è difatti peggiore della prestazione del codice vecchio, vi è ancora una certa probabilità (che decresce esponenzialmente) che il test dell’operazione 540 dia un esito positivo, portando a una sostituzione del codice all’operazione 545. Questa possibilità può aiutare il sistema a evitare di restare intrappolato in un massimo locale, in quanto consente che in alcune circostanze l’ottimizzazione si allontani dal massimo (locale).
Si noti che la sensibilità del processo di decisione può essere modificata moltiplicando il valore del delta della prestazione (Pn-Pr) per un fattore di sensibilità nell’operazione 540 (questo è analogo a variare la temperatura in un metodo di ricerca correlato di ‘tempratura simulata’). Il fattore di sensibilità può essere modificato tra le iterazioni se appropriato. Tuttavia, per le ricerche di codice descritte nella presente, è stato trovato che un fattore fisso di unità sia soddisfacente, come illustrato nella Figura 5.
Viene ora eseguito un test per vedere se è stata realizzata (550) una prestazione obiettivo (Pt). Se così, è stato localizzato un codice secondario adeguato, e la ricerca può terminare (560). In una forma di realizzazione, il livello di prestazione obiettivo (Pt) è impostato approssimativamente a quello del codice secondario di riferimento peggiore (dalla Tabella 3). In alternativa, se il test all’operazione 550 determina che la soglia di prestazione non è superata, l’elaborazione ritorna all’operazione 525 per ribaltare un bit aggiuntivo casuale del codice (modificato). Si noti che questa verifica d’anello è sottoposta a test per un numero massimo di iterazioni (555), che in una forma di realizzazione è impostato a 1 milione. Se viene raggiunto questo limite, allora vi può essere un problema di convergenza, e si decide di tornare all’operazione 510 per generare un codice di riferimento Cr casuale completamente nuovo.
Si apprezzerà che il diagramma di flusso della Figura 5 è presentato soltanto a scopo di illustrazione, e la persona esperta sarà consapevole delle molte variazioni e modifiche potenziali. Per esempio, invece di ribaltare un singolo bit all’operazione 525, la procedura potrebbe selezionare in modo casuale uno 0 e un 1 dal codice da ribaltare. Questo assicurerebbe pertanto che è stato mantenuto il bilanciamento nel codice. Inoltre, la strategia di ottimizzazione può tenere in considerazione uno o più altri criteri (oltre a o al posto di quelli già discussi). Per esempio, una possibilità potrebbe essere richiedere che il primo lobo laterale (vale a dire corrispondente a uno spostamento di bit in una posizione) della funzione di autocorrelazione (ACF) sia zero per ciascun codice. Questa è una proprietà utile in quanto assicura che la ACF abbia un comportamento noto (fisso) nelle vicinanze dello sfasamento nullo, il che può aiutare con le strategie per mitigare effetti di cammini multipli. Inoltre, la procedura di ottimizzazione può non uscire necessariamente una volta che è stata raggiunta una data soglia di prestazione (all’operazione 550), ma può continuare per almeno qualche altra iterazione per provare a trovare una configurazione binaria anche migliore.
La procedura illustrata nella Figura 5 è stata utilizzata per cercare codici secondari adeguati di 50 e di 100 bit. Si noti che in questo stadio le proprietà reciproche della CCF tra codici non sono state prese in considerazione. La lista di tutti i codici trovati dalla procedura della Figura 5 è stata in seguito controllata per assicurare che includesse soltanto codici indipendenti (corrispondenti all’operazione 410 nella Figura 4). In particolare, qualsiasi codice inverso, rovesciato o spostato in modo ciclico scoperto è stato rimosso. (Difatti svariati codici ripetuti sono stati trovati e rifiutati durante la ricerca di codici secondari di 50 bit idonei, ma non sono state trovate tali ripetizioni durante le ricerche di lunghezza di codice di 100 bit, probabilmente a causa dello spazio di ricerca molto maggiore).
La Tabella 6 illustra la gamma di valori di prestazione sui 100 migliori codici secondari di 50 bit che sono stati trovati utilizzando la procedura di ricerca della Figura 5. I 100 codici sono stati selezionati da un totale di 1304 codici che si è coperto avessero superato la soglia di prestazione Pt (sebbene non ci si aspetti che ciò sia esaustivo).
Tabella 6: Riepilogo dei Risultati della Ricerca di Codice Secondario di 50 Bit.
Codice Prestazione HNVp MFp ELW Bilanciamento DC
CS501 623,80 625,00 12,76 1,33 0
CS502 623,80 625,00 12,76 1,33 -6
~ ~ ~ ~ ~ ~
CS5099 623,37 625,00 12,76 1,76 -2
CS50100 623,37 625,00 12,76 1,76 -2
A titolo di confronto, i codici secondari di 50 bit di riferimento attuali CS50a e CS50b dalla Tabella 3 sono nelle posizioni rispettivamente 1146 e 1294 sul totale dei 1304 codici secondari identificati. Si noti che i primi 324 codici trovati hanno i HNV della ACF di soltanto 2, che è una prestazione molto migliore dei due codici di riferimento originali che hanno HNV di 6.
Analogamente, la Tabella 7 illustra la gamma dei valori di prestazione sui 200 migliori codici secondari di 100 bit sui 981 che è stato riscontrato che superino la soglia di prestazione. In questo caso sono scelti i primi 200 codici, in quando i codici di questa lunghezza sono destinati ai segnali pilota E5A-Q e E5B-Q. Si noti che il secondo miglior codice nella Tabella 7 è il codice di riferimento attuale CS100d dalla Tabella 3, mentre gli altri codici di riferimento CS100a-c sono nelle posizioni rispettivamente 981, 980 e 733.
Tabella 7: Riepilogo dei Risultati della Ricerca del Codice Secondario di 100 Bit.
Codice Prestazione HNVp MFp ELW Bilanciamento DC
CS1001 154,60 156,25 8,12 1,73 4
CS1002 154,55 156,25 7,02 1,77 -8
~ ~ ~ ~ ~ ~
CS100199 154,29 156,25 5,53 2,01 8
CS100200 154,29 156,25 5,21 2,01 6
I codici precedenti sono stati selezionati tutti senza testare la prestazione della CCF. Il passo successivo è pertanto di selezionare, dall’insieme completo dei codici secondari trovati, un gruppo di almeno 50 codici (per ciascun segnale) che abbiano anche delle buone proprietà reciproche della CCF. Tuttavia, occorre notare che questa prestazione non dovrebbe essere peggiore della situazione attuale, in cui tutti gli elementi del codice utilizzano lo stesso codice secondario (comune).
Testare tutte le combinazioni di 100 codici qualsiasi da un insieme di soltanto poche centinaia di candidati non è fattibile utilizzando i mezzi computazionali attualmente a disposizione, specialmente quando sono permessi vari spostamenti Doppler (che avranno effetto sulla prestazione della CCF tra differenti codici di satellite). Di conseguenza, è stato realizzato un altro processo di ottimizzazione.
In una forma di realizzazione, sono stati utilizzati due metodi, che utilizzano entrambi la stessa procedura di ottimizzazione. Ciascuno di questi metodi inizia con un insieme di 100 codici selezionati in modo casuale scelti dall’insieme di approssimativamente 1000 codici trovati attraverso il metodo della Figura 5 (come descritto sopra). I due metodi successivamente sostituiscono uno dei codici per ciascuna iterazione, attraverso una scelta casuale per un metodo, o identificando il codice che ha fornito il contributo di CCF peggiore per l’altro metodo. Tuttavia, in questa forma di realizzazione, è stato trovato che sia relativamente difficile ottimizzare (far convergere) la famiglia complessiva della CCF, specialmente quando siano inclusi gli effetti dello spostamento Doppler, in quanto la velocità di iterazione era lenta e il programma di ricerca regolarmente si bloccava nei massimi locali. In particolare, l’impatto della delta di cambiare un codice singolo potrebbe essere sommerso dalle variazioni della prestazione della famiglia complessiva di CCF. Un fattore che ha effetti sulla velocità era che il programma di ricerca ricalcolava continuamente quasi le stesse CCF per ogni iterazione, sebbene difatti soltanto le CCF che includevano il codice sostituito avessero necessità effettivamente di essere calcolate per una nuova iterazione. Il programma di ricerca è stato pertanto modificato per sostenere questo cambiamento al fine di velocizzare la velocità di iterazione. Sono stati fatti anche dei tentativi per migliorare la sensibilità ai cambiamenti di codice individuale sintonizzando i criteri della prestazione; tuttavia, la velocità di convergenza è rimasta piuttosto lenta.
In un’altra forma di realizzazione, è stato intrapreso un approccio alquanto differente. In questa forma di realizzazione, sono state calcolate le CCF di tutte le combinazioni di coppie di codice per l’insieme completo dei codici. La matrice delle CCF calcolate includeva anche una gamma di spostamenti Doppler in frequenza, precisamente di 25 passi, ciascuno di 20 Hz, per i codici secondari di 50 bit, e di 50 passi, ciascuno di 20 Hz, per i codici secondari di 100 bit. Questi hanno prodotto spostamenti massimi di 500 Hz e di 1000 Hz per i codici secondari rispettivamente di 50 bit e di 100 bit, che corrispondono alle frequenze di ripetizione dei codici primari corrispondenti. A questi spostamenti in frequenza il cambiamento di fase per il chip del codice secondario diventa 2π, dopo di che l’effetto Doppler sui codici secondari si ripete come discusso precedentemente.
Sebbene questa forma di realizzazione utilizzi una grande quantità di memoria o di memorizzazione, essa evita la ripetizione di calcoli della CCF dispendiosi in termini di tempo. Il processo di ottimizzazione conseguente è pertanto molto più veloce, in quanto include soltanto trovare l’insieme migliore di codici utilizzando i valori delle CCF calcolati in precedenza e uno o più criteri adeguati che combinino la famiglia dei valori della CCF. Per esempio, possono essere realizzati gruppi di codice eliminando i codici che è possibile osservare avere valori di CCF scarsi, o selezionando codici che abbiamo valori di CCF buoni.
In una forma di realizzazione, i criteri di ottimizzaz
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